【DIA】Nature Commun：重磅技术升级！或驱动蛋白磷酸化修饰分析跨入新篇章

大规模磷酸化修饰研究瓶颈

磷酸化修饰被很多研究者认为是修饰之王，是生物体内极为重要的一种翻译后修饰：从数量上来说，真核生物体内有超过三分之一的蛋白可以发生磷酸化修饰；从功能上来说，磷酸化在正常生理、免疫应答、疾病的发生发展，及植物的逆境胁迫响应与激素表达等各种生物过程中均发挥至关重要的作用。近年来，随着质谱技术的快速发展及应用，基于质谱的磷酸化蛋白质组学分析已成为全局观测磷酸化动态变化的重要方法。但是，由于翻译后修饰本身丰度远低于未修饰蛋白，且修饰状态变化灵敏快速等特点，导致在传统质谱检测模式下检测效率以及检测重复性仍然存在较多问题。这个问题在大规模样本分析，例如大队列研究中，会变得更加明显。随着全扫描蛋白质组技术DIA (data independent acquisition) 的“问世”，上述问题被认为有希望得到解决。然而，图谱的解析是DIA技术目前面临的主要问题。因为DIA这种全扫描的模式获得的图谱极其复杂，该复杂性在翻译后修饰上得到放大：在复杂的质谱图谱中不仅要鉴定蛋白的序列，还要进一步进行修饰位点的鉴定与定位。磷酸化修饰组的DIA数据分析，尚无很好的解决方案。

大规模磷酸化修饰分析新突破

2020年初，来自丹麦哥本哈根大学Jesper V. Olsen团队，在《Nature Communications》上发表文章“Rapid and site-specific deep phosphoproteome profiling by data-independent acquisition without the need for spectral libraries”，对于磷酸化的大规模深度检测的瓶颈问题进行了针对性的实验优化，软件算法优化，开发了基于DIA的磷酸化蛋白质组学的整体工作流程，为实现快速且高深度的磷酸化位点鉴定大规模全扫描磷酸化组分析带来了突破性解决方案。该研究成果解决了磷酸化DIA分析的两大核心问题，并给予强有力的实验证据。具体如下：

磷酸化DIA VS 磷酸化DDA：定性更多，定量更准

在技术路线方面，作者通过DDA（传统数据依赖性方法），优化的DIA（先DDA建库，再DIA检测）以及dDIA（directDIA，通过搜索DIA原始文件谱图来直接生成库）三种实验条件的对比，结果发现优化后的DIA方法获得13220条磷酸化肽段，比传统方法（DDA）的7285条磷酸化肽段将近提高一倍，实现了磷酸化的深度检测（见图1b）。此外，DIA、dDIA鉴定重复性、定量平行性也优于DDA, 其中DIA在两个重复中的相关系数R2为0.93，而DDA的R2为0.89（图1e）。

图1. 基于DIA的磷酸化蛋白质组学拥有更高深度、更好重现性

为进一步测试比较DDA与DIA的定量准确性、精确度，研究团队采用不同比例的酵母与HeLa细胞的磷酸化肽段混合肽进行分析，箱形图的结果表明DIA和DDA的定量准确性相当（见图2j）。通过计算均方误差（SAM-test和d-score算法）评估三种方法的定量精确度，结果表明DIA在所有条件下均表现出优越的定量准确性与精确度（图2k）。通过计算显著差异调节的磷酸化肽检出的真阳性率（TPR）和假阳性率（FPR），发现DIA和dDIA 比较与传统DDA模式，真阳性率（TPR）大幅度增加（图2I）。以上一系列结论表明DIA在磷酸化修饰定量准确性上有非常大的优势。

图2.基于DIA的磷酸化蛋白质组学拥有更高准确性与精度

磷酸化DIA的数据分析难题-DIA已有软件与PTM新算法的完美融合

DIA确实比DDA更具优势，但是DIA数据分析的瓶颈如何解决呢？相较于DDA的数据依赖性采集模式，DIA采用全扫描的方式，虽然采集到的数据量深度大大增加，但是随之带来的是图谱复杂性增大，数据解谱问题比传统DDA面临更大的挑战。虽然在DIA常规蛋白质组学的数据分析方面，已有成熟的分析解决方案- SpectronautTM，该软件在顶级方法学研究学术期刊《Nature Biotechnology》的DIA分析软件横评中，展现出了准确度、灵敏度和速度的显著优势。但是在以往SpectronautTM版本中对于翻译后的位点定性支持有限，也在一定程度上限制了翻译后修饰在DIA技术方面的大规模应用。本研究成果采用DIA的方式进行磷酸化组学研究，作者在翻译后修饰位点的精确定位问题上也有充分的考量以及解决方案。作者专门开发了一套用于PTM的算法，并且与SpectronautTM软件进行嵌合，解决了采用DIA方式进行翻译后修饰分析的后顾之忧。在本文中，作者也详细介绍了PTM算法的原理，该算法结合碎片离子的完整同位素图谱、以及生成短洗脱色谱图以与目标前体峰形相关的可能性，进一步结合碎片离子强度和质量准确性，用于计算最终位点得分。后续测试表明，该算法的筛选能力与DDA模式下采用MaxQuant分析软件中Andromeda得分算法能力相当。对该算法感兴趣的老师可以戳图3。

图3.匹配DIA磷酸化组的PTM打分算法

总结

该篇研究成果之所以引起广泛关注，不仅因为发表于权威期刊，更重要的是本文提供了一个突破性的解决方案—磷酸化DIA，不管是在技术路线的方法选择，还是在后期软件分析，都给了我们很好的示范和例证，使得翻译后修饰的DIA大规模应用将会成为可能，也将为翻译后修饰研究领域带来更多惊喜和突破性的进展。

这么好的技术，离我们有多远？

附测试结果及DIA磷酸化福利

该文献报道的DIA磷酸化技术，触手可及！！作为拥有多年磷酸化修饰分析服务经验，以及拥有大量成熟分析经验的DIA分析平台，同时作为SpectronautTM软件方Biognosys AG公司认证授权的CRO服务公司，中科新生命紧跟前沿，DIA蛋白质组学服务将再添利器—— DIA磷酸化蛋白质组学服务，目前已经启动建立并优化磷酸化DIA的大规模组学方法，推动深度高通量磷酸化组学分析成为现实。以下跟各位老师分享下我们的测试结果。

【中科新生命】测试数据展示

上述文献中，研究团队主要采用细胞样本进行DIA磷酸化的分析。那么其他常见样本类型的效果如何呢？因此，我司选用了一组组织样本，进行了心肌组织的DIA磷酸化的测试评估。同时，我们也与文献报道的磷酸化组结果进行了参比，该参比文章于2016年发表于美国科学院院刊《PNAS》上，基于LTQ-Orbitrap平台系统，采用DDA采集模式，研究了小鼠心肌组织样本的磷酸化组与病理的关系。具体如下。

测试设计

测试结果

PNAS文章报道的心肌组织样本分析，鉴定到了将近4000条左右磷酸化肽段（发表年限相对较早，仅供参照），中科新生命的DDA分析鉴定到了平均约4600条磷酸化肽段，中科新生命的dDIA分析则鉴定到了平均超过11000条磷酸化肽段，鉴定数量是中科新生命DDA模式的两倍以上。值得注意的是：在鉴定重复性上，dDIA模式中的三次技术重复所鉴定到的磷酸化肽段的重复性达88%以上；在定量稳定性上，三次技术重复的CV值约10%，展现出了优越的稳定性能力。这对于丰度较低、检测随机性较高的蛋白修饰而言，具有非常大的价值，对于大规模样本的磷酸化蛋白质组研究具有很大的应用前景。友情提示：以上是为心肌组织样本的测试结果。不同生物背景、不同类型样本的磷酸化修饰分布和含量等会有所差异，具体样本和项目的提升效果，需要具体分析。