菌群移植！代谢组学揭示新生儿肠炎治疗的作用机制

新生儿坏死性小肠结肠炎（NEC）是早产儿、低体重出生儿最常见的急腹症之一。妊娠32周之前出生的早产儿可能有5-15%发病比例，高死亡率（达30％），并和慢性病（例如神经发育受损）有关。早产儿由于肠道不成熟而易患NEC。

研究显示，早产儿益生菌群预防治疗，可减少其发生NEC的风险，并降低疾病的严重程度。粪便微生物菌群移植（FMT）是从健康的供体中摄取含有远端肠道菌群的粪便物质转移到受体的胃肠道。FMT因有效纠正一些成年患者组（尤其是艰难梭菌属感染复发患者）肠道微生物菌群失调和临床改善而受到关注。在早产儿中，相对于传统的益生菌而言，包含来自健康供体的平衡而多样化的微生物群的细菌疗法可能在稳定新生儿肠道微生物群方面更为有效，这可能会对NEC的发展产生潜在影响。

2019年, 来自丹麦的研究团队在The ISME Journal期刊发表了题为“Effect of fecal microbiota transplantation route of administration on gut colonization and host response in preterm pigs”的研究成果。研究人员以早产仔猪作为早产儿模型，研究口服+直肠FMT联合给药，以及单独进行直肠给药两种不同的方式，通过应用16S rRNA基因扩增子测序和靶向代谢组学技术比较不同的粪菌移植方式对早产仔猪肠道定植和宿主响应的影响。

The ISME Journal    IF=9.493

技术路线

研究结果

1. 口服+直肠粪菌移植实验结果

1.1临床观察

与对照组相比，口服+直肠FMT组的仔猪5天生存率明显降低。第二天和第三天，与对照组相比，FMT仔猪的运动能力下降。存活至第5天的FMT动物与对照组相比，生长减少，但NEC发生率相对降低60%。组织病理学分析结果显示，病变主要发生在结肠，而胃、肠近端、中部和远端的病变较少。

图1.  不同FMT给药途径的临床反应

1.2 肠道微生物组成和代谢产物

与对照组相比，口服+直肠FMT影响了胃和结肠中的细菌组成。该处理增加了胃中细菌多样性，乳酸菌是FMT组和CON组胃中含量最高的菌属，但CON组中肠球菌（Enterococcus）和Leuconostoceae中未分类菌属的相对丰度较高。在结肠中，FMT降低了肠球菌的相对丰度，同时专性厌氧拟杆菌属（Bacteroides）和普氏杆菌（Prevotella）的相对丰度增加。

图2. 不同的FMT给药途径处理后肠道菌群组成

研究人员进一步分析代谢产物（包括D和L-乳酸、乙酸、丙酸、丁酸等短链脂肪酸（SCFA）的变化。与对照组相比，口服+直肠FMT导致胃细菌密度增加10倍，总有机酸增加了三倍。主要原因是由于乳酸水平升高，乙酸盐和丁酸盐也显著增加并伴有胃pH值增加。结肠中，总细菌密度不受FMT处理的影响。然而，与CON组相比，FMT仔猪的总结肠有机酸有所降低，原因是最丰富的代谢产物乳酸水平降低。而FMT处理后丙酸水平升高了4倍 ,FMT仔猪的结肠腔内pH值明显更高。

图 3. 肠道菌群代谢和上皮粘附

1.3 肠粘膜结构、功能和免疫反应

在喂养配方奶粉的早产仔猪中，大量细菌沿着整个小肠黏附在绒毛上，表明粘膜屏障破坏。经口服+直肠FMT处理的动物中，尽管粘膜免疫反应有所降低，但通过定量FISH染色发现，粘附细菌的丰度高于对照组。因此，相对于NEC患病对照组，FMT动物小肠中微生物抗原识别受体TLR2的表达水平升高，而促炎性TLR4的表达下降。此外，在仅使用NEC的对照中，包括TNF，IL6，IL8和IL17A在内的几种细胞因子的表达增加。与对照组相比，FMT仔猪的近端小肠绒毛更长，乳糖酶和二肽基肽酶-IV活性增加。肠通透性和己糖吸收不受影响。

配方奶粉喂养后，含粘蛋白的结肠杯状细胞的密度通常较低，并且粘蛋白池的消耗发生在局部。在口服+直肠FMT处理的动物中，结肠中粘蛋白的密度显著高于对照组，这可能是由于CON动物的NEC负担增加，因为NEC的严重程度与粘蛋白密度呈反比。与未受影响的对照组相比，患有严重NEC的对照动物的结肠中IL-1β，IL-8和IL-10蛋白水平均显著升高，而FMT组的结肠中IL-1β水平处于中等水平，并且IL-8和IL-10水平与对照NEC动物水平相当。

图4. 宿主肠道响应口服+直肠FMT

1.4 细菌学，血液学和临床生物化学

口服+直肠FMT治疗第5天增加了肝脏、脾脏的细菌定植, 而第1、2和3天仅有少量血液样本阳性，各组之间没有差异。两组均鉴定出葡萄球菌和肠球菌，但分别有17％和39％的FMT动物大肠杆菌和猪链球菌定植，对照动物中则没有。此外，与第5天的对照组相比，FMT使总血白细胞，中性粒细胞和淋巴细胞增加了2到3倍。与对照组相比，口服+直肠FMT中肌酐和γ-谷氨酰转移酶（肾和肝功能受损的标志物）均升高。

2. 直肠粪菌移植

2.1 临床观察

结果显示，直肠FMT不影响仔猪5天生存期。此外，直肠FMT 均不影响运动活动和生长速度的临床参数。直肠给予FMT仍可将NEC相对发生率降低75％。在该实验中，NEC病变主要发生在中小肠或远端小肠，胃部、近端小肠和结肠病变较少。

2.2 肠道微生物组成和代谢产物

直肠FMT治疗改变了胃和结肠的细菌组成。此外，与口服+直肠治疗相反，直肠FMT增加了结肠的细菌香农指数（p <0.01），但胃微生物群组成没有增加。胃细菌的组成类似实验1，乳酸菌是优势菌。然而，直肠FMT动物细菌的组成与对照组不同，乳酸杆菌的相对丰度更高，球肠菌、葡萄球菌和链球菌减少或消失。在结肠中，细菌组成变化与实验1相似，但直肠FMT后变化更为明显，包括肠球菌以及专性拟杆菌大量减少。此外，FMT处理后，乳酸杆菌和大肠埃希菌丰度增加。应用PICRUSt功能预测直肠FMT后结肠中细菌组成的变化，发现直肠FMT导致了包括多种微生物-宿主信号通路富集。值得注意的是，FMT增加了TLR4配体脂多糖的合成，而TLR2配体肽聚糖的合成减少。

直肠FMT后肠道细菌密度的趋势与实验1相似，尽管胃细菌负荷的增加不明显。与口服+直肠FMT不同，直肠FMT治疗对胃中短链脂肪酸的影响最小，pH降低。此外，实验证实FMT可提高结肠中丙酸水平和腔内pH。

2.3 肠粘膜和系统响应

FMT途径对小肠粘膜黏附细菌的丰度有不同的影响。与实验1相反，与对照组相比，直肠给药减少了细菌黏附。直肠FMT给药不会影响任何肠段的绒毛形态，但与实验1相似，它增加了近端乳糖酶活性，对剩余的消化酶或肠通透性没有影响。由于结肠NEC发生率低，因此直肠FMT不会影响结肠杯状细胞的粘蛋白密度。同样，促炎细胞因子IL-1β水平要低得多。与实验1相比，两组之间没有明显差异。有趣的是，直肠FMT后白细胞反应与先前的实验相同，循环淋巴细胞（p <0.05）和嗜中性粒细胞（p <0.001）增加，然而内部器官功能障碍标记物（例如肌酐，γ-谷氨酰转移酶）没有升高。

图5. 导致粘膜损伤和NEC的肠腔事件，以及通过FMT的预防的概念图

早产儿中，配方奶粉喂养有利于兼性厌氧菌乳酸菌的定植和生长，从而导致乳酸过量生产，进而降低了管腔中pH值并抑制了利用乳酸的细菌的生长。缺乏SCFA的产生，减少了肠腔中碳酸氢盐的分泌。较低的管腔pH值会抑制紧密堆积的粘蛋白的展开，使粘液屏障功能失调，并使粘膜容易受到细菌的侵袭。而FMT处理会引入利用乳酸的细菌，例如拟杆菌，它将细菌的新陈代谢改变为消耗乳酸和产生SCFAs。较低的乳酸和SCFA和碳酸氢根的潜在交替的结合确保了管腔中性pH。这可以使分泌的粘蛋白正确展开，从而维持足以保护上皮表面免受细菌的入侵的物理屏障，从而防止粘膜损伤和NEC。

小结

本研究对比了两种不同给药途径对早产仔猪肠道定植模式和宿主对粪便微生物移植的响应。结果发现，口服+直肠FMT联合给药治疗的方式降低了NEC的发生率，但会增加细菌黏附，内部器官定植和总体死亡率。而仅进行直肠FMT，可以降低NEC，并且对生存、运动、生长或者血液生化都没有负面影响。因此，早产新生儿对FMT治疗的临床反应取决于给药途径，直肠给药是优选的给药途径，因为口服FMT会通过使近端肠道暴露于来自供体粪便潜在的病原体从而增加了细菌迁移和致死性败血症的风险。

原文链接：https://doi.org/10.1038/s41396-018-0301-z