Label free与PRM揭示球藻应对缺铁环境的具体机制

Label-free定量蛋白质组学技术是最为传统的一种蛋白质组学定量技术，一般是以峰强度/信号或者谱图数进行定量比较，并且对实验的重复性具有非常高的要求。在蛋白质组学实验中，先通过差异定量的蛋白质组学技术进行大规模的差异蛋白的筛查，再利用目标蛋白质组学技术对感兴趣的蛋白进行绝对定量验证，已经成为一种越来越常见的趋势，特别是对很难找到抗体的目标蛋白质进行绝对定量时，目标蛋白质组学技术往往是一种更好的选择。

Proc Natl Acad Sci U S A：采用大规模蛋白质组学定量技术（Label free）以及目标蛋白质绝对定量技术（PRM）揭示球藻应对缺铁环境的具体机制

文献来源：Divergent response of Atlantic coastal and oceanic Synechococcus toiron limitation. Proc Natl Acad Sci U S A. 2015; 112(32): 9944-9.

摘要简介：

海洋聚球藻是分布最广泛的浮游植物，而铁元素是众多海域里限制其生长的重要因素。为了研究沿海以及远洋聚球藻菌株适应不同丰度铁元素的机制，该课题组比较了来源于具有不同丰度铁元素海域的聚球藻菌株的生长、生理以及蛋白质组。

马尾藻海南部海域有大量来自撒哈拉沙漠的尘暴沉积，使得该海域铁元素含量较高，且常年处于一个比较稳定的状态，来自于该海域的WH8102菌株在铁元素丰度下降后生长和生理都受到了显著的损害，没有表现出明显的响应反应。WH8020是一种沿海的聚球藻菌株，来自于不断变化的四季分明的新英格兰大陆架，在面对不同铁元素丰度的环境时则呈现多层次的响应反应。这些响应反应包括铁元素获取以及贮存、光合作用等相关蛋白质的改变、黄素氧还蛋白替代铁氧还蛋白以及一些生理现象的变化。这些多层次的响应机制保证了菌株在不同铁丰度的环境中具有相对稳定的生长速率。

同时该研究还发现两个铁元素吸收调节因子的改变与WH8020多重的蛋白质组响应反应相关，这也暗示沿海菌株与远洋菌株相比在低铁元素的环境中具有不同的调节阈值。

另外，研究还发现远洋海域中铁元素丰度长时间之内保持稳定，其低氮以及低磷环境有可能会促使菌株中铁元素响应基因丢失，而这些基因在铁元素丰度变化较大且氮元素和磷元素都很丰富的沿海海域里的菌株中则存在。

技术路线：

该课题组取马尾藻海南部海域的WH8102以及WH8020，在低铁培养基中培养一段时间后转入无铁培养基，最后加入不同浓度的铁元素进行恢复，然后取这些藻体进行大规模的蛋白质组相对定量分析（labelfree）和目标蛋白质的绝对定量分析(PRM)。在藻体培养过程中同时进行生长状态和生理指标的记录。 

研究结果：

实验结果显示马尾藻海南部海域的WH8102相较于来自新英格兰大陆架的WH8020而言在不同丰度的铁元素环境中生长速率和Fv/FM（一个光生理指标）都不如后者稳定。这意味着来自新英格兰大陆架的WH8020对铁元素丰度具有更好的适应性。

Label-free结果显示沿海菌株WH8020在不同铁元素丰度环境中具有非常大的蛋白质组差异，包括一些铁元素感知、铁元素摄取以及储存的蛋白质丰度都发生了显著的变化。而进一步的分析显示在WH8020适应不同浓度铁元素丰度的环境中两个铁元素吸收调节因子(Fur)的异构体具有十分显著的调节功能，他们分别调节该菌株在低浓度以及高浓度铁元素环境中的相应反应。而远洋菌株WH8102在不同铁元素丰度环境中则未发现明显的适应铁元素丰度变化的机制。

Fig.2. Physiological and photosynthetic responses of oceanic WH8102 (Left, A–E) and coastal WH8020(Right, F–J) to [Fe′].Verticaldashed lines in Aand Fand bars in Band Gindicate the concentrationof Fe′ (plotted aslog[Fe′]) at which a given physiological parameter showed a thresholdresponse (Materials and Methods). Growth rate (circles) and photosynthetic efficiency (Fv/FMmeasured at the time the protein samples were collected, shaded regions) areshown in Aand F.ETC, membrane proteins in the photosynthetic electron transport chain. Growthcurves are shown in C and H and photosynthetic efficiency (Fv/FM) valuescollected each day are shown in D and I. Legend for C, D, H, and I is shownbelow I. (E and J) Heatmap of photosynthetic electron transport chain proteinsfor Synechococcus sp. strains WH8102 (E) and WH8020 (J). Normalized spectralcounts are given in SI Appendix, Table S4. Color indicates higher (yellow) orlower (purple) abundance relative to the centered mean value (black).

以上结果与原先学界推测并不一致，可能原因主要有两个，一是有些远洋海域比如马尾藻海南部海域因为大量来自撒哈拉沙漠的尘暴积累，导致海域里的铁元素含量很丰富并且常年相对稳定；二是铁元素丰度适应机制不仅与铁元素本身丰度有关，还与其他元素的丰富程度具有十分显著的关系。

该课题组对两个菌株的基因组大小及磷含量进行了比较，同时采用蛋白质绝对定量方法(PRM)对WH8020不同铁元素丰度环境适应过程中具有重要影响的蛋白质进行了绝对定量，同时分析了这些蛋白质合成所需的N元素总量，发现海域里P、N元素的丰富程度与这些基因在染色体中是否存在以及相关蛋白质能否表达有关。由此，该课题组认为铁元素适应过程及适应机制不仅与铁元素本身有关，还和周围环境中P、N元素的丰富程度相关。

该研究打破了原先学界猜测，发现沿海聚球藻菌株对于不同丰度铁元素环境的适应能力相较于某些远洋海域的聚球藻更强，并且通过大规模蛋白质组学相对定量技术（labelfree）发现了沿海菌株应对铁元素的相应机制，同时通过染色体分析以及蛋白质绝对定量分析技术（PRM）发现了铁元素响应机制与周边环境P,N元素丰富程度之间的联系，为进一步揭示聚球藻的生长机制以及类似的研究提供了非常丰度的数据积累和参考价值。