客户文章 | 蛋白质组学揭示儿童生长迟缓的秘密

HepG2细胞经含12.76 nmol/L维生素B2的培养基培养一段时间后，转移至含0.76, 3.76, 6.76, 12.76, 24.76, 48.76 nmol/L维生素B2的培养基中，培养96h后收集细胞样本。

Label-free蛋白定量分析

常规细胞学实验

1. 细胞活性、细胞凋亡和谷胱甘肽还原酶活性测定

维生素B2缺乏的培养条件下(维生素B2浓度为0.76, 3.76, 6.76 nmol/L)，细胞活性显著降低；当浓度高于12.76nmol/L, 细胞活性基本不受影响。细胞凋亡实验结果的趋势与之类似。此外，维生素B2浓度低于12.76nmol/L时，谷胱甘肽还原酶（其活性系数常用来评价维生素B2营养状况）的活性也显著降低。

Effect of riboflavin on cell viability,apoptosis and glutathione reductase activity. 

2. Lable-free蛋白定量分析

文章总共鉴定到3730个蛋白，其中，有85个蛋白只出现在维生素B2缺乏培养条件下的HepG2细胞中；275个蛋白只出现在充裕的维生素B2培养条件下的HepG2细胞中。对以上360个蛋白进行GO分析发现，多数蛋白参与磷酸盐代谢过程,脊索动物的胚胎发育和蛋白质磷酸化等生物过程。其中，在维生素B2缺乏培养条件下的HepG2细胞中，有37个蛋白差异表达非常显著(±2 fold, p < 0.05)，它们广泛参与代谢过程、氧化还原、电子传递等非常重要的生物学过程。

Hierarchical cluster of proteins differentially expressed between riboflavin deficient (test 1–3) and riboflavin adequate(control 1–3) samples with an FDR < 1% identified by MaxQuant. 

3. KEGG通路富集分析

进一步对差异蛋白进行KEGG通路分析发现，与类固醇激素生物合成、丙酮代谢、脂肪酸降解、脂肪酸代谢、柠檬酸循环、碳代谢、脂肪代谢、氧化磷酸化、辅酶合成、酒精代谢，以及帕金森病、系统性红斑狼疮和非酒精脂肪肝等疾病的发生相关的代谢通路得到显著富集。

KEGG Pathway analysis. 

4. 蛋白互作网络分析

为进一步阐明维生素B2缺乏所引起的蛋白谱的变化，文章对差异表达蛋白进行以下互作网络分析，其中与能量代谢相关的蛋白处于网络中较为中心的位置，与其他蛋白联系更加紧密。

Protein–protein interaction analysis performedby InAct. 

5. 对差异表达的蛋白进行WB验证

选择5个差异表达的蛋白进行westernblot验证，结果与质谱数据一致。

Immunoblotting validation of differentially expressed proteins.

文章首次利用Lable-free蛋白定量技术研究了维生素B2缺乏对HepG2细胞蛋白表达的影响，结合生物信息学分析发现，很多与能量和脂质代谢相关的蛋白在维生素B2缺乏时下调表达显著，与细胞凋亡相关的蛋白表达水平也发生了明显变化。然后对一些重要的差异表达蛋白进行WB验证，结果与质谱数据一致。这些数据对相关疾病的研究提供了很好的基础，在一定程度上提示大家，适当增加核黄素摄入量有助于治疗助儿童和青少年中常见的生长发育迟缓。