客户文献 | 茶为什么那么好喝？

Editor's notes

游离氨基酸是茶叶中的重要营养成分,在茶叶中已发现二十多种游离氨基酸,而通过饮茶可以摄取多种氨基酸,对于身体健康有很大好处。通过对茶树植物进行黑暗处理可以显著提高叶片中游离氨基酸，这对于我们早已不陌生，但具体的调节机制仍然不清楚。本文拟采用定量蛋白组学结合其它生物学技术来系统地研究黑暗处理对茶树叶片游离氨基酸形成的影响。中科新生命，成立于2004年，专注于质谱技术方法在科技服务、生物医药、精准医疗领域的应用开发。12年质谱服务经验，每年处理样本数超万例，通过与中科院的技术合作及企业研发团队的自主创新，致力成为您最具价值的生物技术合作伙伴。

实验组：茶树经黑暗处理2周；

对照组；茶树不经任何处理 (茶树种植于华南农大茶叶基地)

蛋白定量iTRAQ实验（上海中科新生命公司）；

投射电镜观察实验；

常规生化实验。

1.    茶树经黑暗处理后，叶片中的游离氨基酸含量明显增加，而可溶性蛋白含量显著降低

茚三酮实验结果表明，与对照组相比，茶树经2周黑暗处理后，茶树叶片中的游离氨基酸含量明显增加，而可溶性蛋白含量显著降低；这意味着游离氨基酸含量增加和可溶性蛋白含量降低之间可能存在某种关系。推测可能的机制有两个：a,黑暗处理条件下，游离氨基酸合成相关通路被激活；b, 黑暗处理条件下，蛋白水解为游离氨基酸。

对照组和实验组植株表型、游离氨基酸和可溶性蛋白含量比较

2.    黑暗处理条件下，与游离氨基酸合成相关的多数酶是表达下调的

为研究游离氨基酸的积累是否是相关合成通路激活所致，对黑暗处理组的茶树叶片和对照组茶树叶片进行蛋白提取和iTRAQ实验，结果共找到8224个唯一肽段和3889个蛋白组。实验组与对照组相比，差异蛋白数量有226个（差异倍数≥1.2且p＜0.05），其中上调的有71个，下调的有155个。对差异表达的蛋白进行GO注释和KEGG通路分析。结果表明，在226个差异表达的蛋白中，有206个蛋白富集到121个代谢通路中，最显著富集的三个通路分别是与氨基酸合成、内质网中蛋白加工以及半胱氨酸和蛋氨酸代谢相关。在差异表达的蛋白中，与氨基酸代谢相关的有17个，其中8个跟氨基酸合成相关。其中与氨基酸合成的三个重要的酶是表达下调的，这表明黑暗处理条件下氨基酸的积累可能不与合成氨基酸的这些酶相关。

3.    叶绿体蛋白水解导致黑暗条件下游离氨基酸的积累

以上结果显示,黑暗处理条件下叶片中游离氨基酸积累并不是由于氨基酸合成通路激活所致，由于黑暗条件下叶片中蛋白水平明显降低（上述Fig.1c）,因此接下来需要进一步研究蛋白水解对于游离氨基酸积累的影响。通过亚细胞分离得到叶绿体和其它细胞器，并对其蛋白含量进行分析(Fig. 3A)。结果表明，实验组叶绿体的蛋白含量明显低于正常组，而其它细胞器的蛋白含量并没有显著差异(Fig. 3B)。对叶片中已知可溶性蛋RuBisCO进行western blot 实验，结果同样证明，其在实验组含量明显低于正常组(Fig.3C)。此外,透射电子显微镜分析观察发现,尽管黑暗处理对叶绿体的结构没有影响，但可显著降低叶绿体的数量(Fig. 3D and E)。而且，多数参与叶绿体的形成和光合作用的蛋白在黑暗处理时显著降低。这些结果表明，黑暗处理茶叶叶片的蛋白水解主要发生于叶绿体,这可能是导致游离氨基酸积累的重要原因。

电镜观察、western blot等实验

黑暗处理可以显著增加茶叶叶片中游离氨基酸的含量，但具体机制仍未阐明。本研究首次结合多种方法包括蛋白质组学和电镜观察和常规生化实验，对黑暗处理可诱导叶片积累游离氨基酸的机制进行详尽系统的描述，结果表明，黑暗处理条件下茶树叶片中游离氨基酸的积累并不是由于氨基酸合成通路的激活所致，而是来源于叶绿体中的蛋白水解。此项研究大大推进了我们对黑暗处理条件下农业作物质量和功能相关代谢研究的理解，此外, 该项研究是一个利用蛋白质组学和其他方法研究相结合的很好的例子, 来系统的研究农作物对环境压力下的代谢机制。