【客户文献】iTRAQ+PRM为植物胁迫研究打call
2017-10-10
中科新生命
3491盐分是影响植物生长发育的一个重要环境因素，盐胁迫对植物的整个生命进程产生影响，盐分通过渗透胁迫、离子毒害等使植物细胞膜通透性发生改变，造成氧化胁迫、代谢紊乱及蛋白质合成受阻等现象，植物的耐盐性主要体现在离子的选择性吸收和区域化作用、渗透调节、光合作用途径的改变以及活性氧清除机制。
本文应用的是非常经典的蛋白质组学研究思路，集合了最常用蛋白质组学技术iTRAQ，以及现在最火爆的验证技术PRM，从蛋白质层面揭示植物耐盐胁迫的机制。
关键词：植物胁迫；iTRAQ；PRM
iTRAQ-based comparative proteomicanalysis reveals tissue-specific and novel early-stage molecular mechanisms ofsalt stress response in Carex rigescens
Environmental and Experimental Botany IF=4.36
白颖苔草（Carex rigescens）在其早期发育中对盐胁迫的蛋白组学变化机制目前还是未知的，所以这篇文章作者通过iTRAQ定量蛋白质组学的技术揭示白颖苔草早期发育相应盐胁迫的分子机制。作者以NaCl处理白颖苔草幼苗的叶和根为样本，前阶段采用iTRAQ筛选特异性蛋白，后阶段分别从蛋白（PRM）和RNA层面进行了验证。
结果与讨论：
1. 白颖苔草盐胁迫不同时间后的生理反应：白颖苔草用300mM NaCl处理6h，12h，24h和48h后观察其相对水含量（RWC），相对电解质（REL），钙离子含量，钾离子含量和钠离子含量等生理指标，发现处理12h后这些生理指标均已经发生显著变化。
2. 盐胁迫12h后白颖苔草叶和根中差异表达的蛋白：作者通过iTRAQ蛋白质组学技术从白颖苔草叶和根中一共鉴定到了9258个蛋白（FDR<1%），鉴定数量非常高，其中6558个来自于叶片，7478个来源于根，叶片和根中共有的蛋白有4778个，占51.6%（下表A）；通过差异比较分析（差异倍数>1.2,p-values<0.05）共找到了1893个差异表达的蛋白，包括叶片中的993个，根中996个，其中在盐处理后下调的有1209个，上调的有726个（下表B）。在这1893个差异蛋白中，只有96个蛋白是叶和根中共有的，其中897个是叶中特有的，900个是根中特有的。
3. 差异表达蛋白的鉴定和分类：在生物学过程（BP），分子功能（MF）和细胞组分（CC）三个方面对差异表达的蛋白进行GO功能注释（fig3），从图中可以看出根和叶中差异蛋白的功能是相似的，它们主要参与了代谢过程，细胞过程和催化结合活性等功能。同时对差异蛋白进行KEGG通路注释和富集分析，发现叶中的差异蛋白主要参与的KEGG通路包括ribosome, carbon metabolism, biosynthesis of amino acids, oxidativephosphorylation, spliceosome, protein processing in endoplasmic reticulum, andglycolysis（fig4）；
而根中的差异蛋白主要参与的KEGG通路包括spliceosome, biosynthesis of amino acids, RNA transport, ribosome,protein processing in endoplasmic reticulum, carbon metabolism, andphenylpropanoid biosynthesis（fig4）。其中参与carbohydrate and energy metabolism, signal sensing and transduction通路的蛋白在根中要比叶片中多（fig5）。
Fig. 3. GO classification of the DEPs detected in C. rigescens.
Fig. 4. KEGG pathway enrichment analysis of the DEPs detected in leaf (A) and root (B) in C. rigescens.
Fig. 5. The number of DEPs involved in the 5 functional categories in leaf and root of C. rigescens.
4. 差异表达蛋白转录水平的验证：从差异表达蛋白中挑选了17个蛋白进行了qRT-PCR表达验证，其中8个是根中特有的，8个是叶片中特有的，1个是二者共有的，结果发现其中13个基因的表达水平和蛋白质组学数据是一致的（fig7）.
Fig. 7. Relative transcript levels of 17 candidate DEPs.
5. PRM验证关键蛋白的表达：从所有差异蛋白中挑选了5个有抗盐功能的蛋白进行PRM表达量的验证，发现5个差异蛋白的表达趋势与iTRAQ结果一致（下表），这证明这次iTRAQ组学结果在未来科学研究中是可信的。
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