【iTRAQ直通车】蛋白质组学技术在环境科学方面中的应用

—— iTRAQ+MRM解析氧化铜纳米材料导致细菌脱氮能力衰退的关键分子机制

文献来源：客户发表

Alteration of intracellular protein expressions as a key mechanism of the deterioration of bacterial denitrification caused by copper oxide nanoparticles. Sci Rep. 2015; 5:15824.

文章摘要：氧化铜等纳米材料在各领域得到越来越广泛的应用，其对人体、藻类等生物的毒性影响也逐渐受到关注，但氧化铜纳米材料对细菌脱氮能力的影响鲜有研究。

Paracoccus denitrificans是一种公认的研究细菌脱氮的模式脱氮菌，广泛分布于水源、土壤、沉积物中，具有将硝酸盐、亚硝酸盐、氮氧化物等转化为氮气的能力。

本文的研究发现氧化铜纳米颗粒（CuO NPs）能够显著影响Paracoccus denitrificans细胞中多个关键蛋白的表达，严重抑制细菌的脱氮能力。当CuO NPs的浓度从0.05 提高至0.25 mg/L时，细菌脱氮效率从98.3% 相应降低至62.1%。

细胞形态和完整性研究发现纳米颗粒能够进入细胞内部。

蛋白质组学研究进一步揭示CuO NPs能够调控氮代谢、电子转运和底物转运相关的蛋白表达，有效揭示了CuO NPs对细菌脱氮的负调控作用和机制。    

实验过程与结果：

脱氮细菌依赖于碳源和硝酸盐分别作为电子供体和受体，以便在厌氧环境中完成脱氮过程。在对照组中硝酸盐被迅速消耗，最终清除率为98.4%。在0.05 mg/L CuO NPs存在的条件下，细菌的脱氮效率是99.1%，与对照组并没有显著差异。然而，随着CuO NPs的浓度从0.1上升至0.25mg/L时，硝酸盐的清除效率分别下降至87.7%和65.6%。  

Figure 1. Effects of CuO NPs on the variations of NO3−-N (solid, A), NO2−-N (hollow, A) and N2O-N (B) during 24 h exposure tests. Error bars represent standard deviations of triplicate measurements.

通常来说，氧化金属纳米颗粒的毒性作用可能与金属离子或纳米颗粒的释放有关。EDS电镜扫描结果显示CuO NPs 能够被吸附于细胞表面，并存在于细胞内部。CuO NPs 能够导致细胞内LDH释放，说明CuO NPs能够破坏细胞膜的完整性。    

Figure 2. Effect of CuO NPs on cellular structure of P. denitrificans. SEM image of bacteria (A), SEM image and EDS analysis of bacteria exposed to 0.25 mg/L CuO NPs (B), LDH release of bacteria exposed to different CuO NPs dose (C), TEM image of bacterial cell without CuO NPs exposure (D), and TEM image and EDS analysis of cells exposed to 0.25 mg/L CuO NPs (E).

作者进一步利用iTRAQ技术分析了CuO NPs的存在所引起的细胞内蛋白质组的改变。蛋白质组分析共鉴定到1499个蛋白质，其中有138个蛋白在0.25 mg/L CuO NPs处理24小时后发生明显的表达改变。作者利用GO、KEGG和蛋白质互作工具对差异蛋白进行生物信息学分析，发现CuO NPs调控的蛋白主要参与氮代谢、电子转运和底物转运相关等生物过程。    

Figure 3. The interaction network of differential proteins induced by CuO NPs. The network was created by the STRING algorithm, and strong interactions are represented by thicker lines.

为了验证蛋白质组结果，作者采用多反应监视的方法（MRM）对细胞内的GtsB蛋白进行检测，发现CuO NPs的表达水平下降到了对照组的80%。进一步分析表明CuO NPs显著降低了葡萄糖的利用以及NADH的水平。  

结论：  

通过iTRAQ蛋白质组学的筛选和MRM技术的后续验证，该研究发现GuO NPs能够破坏P. denitrificans的细胞膜，并进入细胞内，进而引起细胞关键代谢和功能的改变，如电子转运、催化活性等。GuO NPs通过减少葡萄糖转运蛋白，进而引起电子供体NADH不足；CuO NPs能够显著抑制离子转运链中的关键蛋白表达和相关酶的活性。通过对以上生物行为的影响，CuO NPs能够显著引起P. denitrificans的脱氮能力退化。