花生四烯酸调节胆固醇平衡，或可作为心血管疾病治疗的作用靶点

动脉粥样硬化（arteriosclerosis, AS）是动脉硬化中的一种，心血管系统疾病中最常见的疾病，也是严重危害人类健康的常见病与多发病。胆固醇代谢异常是导致动脉粥样硬化损伤的关键因素，而胆固醇代谢异常也常伴随血浆高密度脂蛋白（high-densitylipoprotein, HDL）水平下降。HDL对动脉粥样硬化具有保护作用，可接受体内过多的胆固醇，并将胆固醇从斑块损伤处转运至肝脏，降脂治疗是预防和治疗动脉粥样硬化疾病的有效疗法，而提高HDL含量和功能也成为了辅助治疗AS新途径。

近年研究证实，花生四烯酸的代谢产物与AS的发生、发展密切相关。大量证据表明，在日常饮食中补充包括AA等omega-6多不饱和脂肪酸可改善血脂和脂蛋白的分布并降低冠心病的风险。目前，关于不同AA代谢酶比如脂氧合酶，LTB4、LXs等代谢物对胆固醇作用及其潜在的影响仍未见有相关系统的报道。今天介绍一篇文献通过整合人GWAS分析的数据、构建功能缺失的小鼠模型以及利用脂质组学方法研究LTs和LXs在胆固醇平衡中的作用的文章。

The Arachidonic Acid Metabolome Serves as a Conserved Regulator of Cholesterol Metabolism.

Cell Metabolism IF=18.164

研究材料：

小鼠粪便、血浆、肝脏样本、肝细胞

技术方法：

非靶向脂质组学，体内验证+体外验证

研究路线

1、ALOX5是人体内高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）调控因子

研究人员首先从已发表的全基因组关联分析（genome-wideassociation study，GWAS）的数据中分析参与AA代谢的酶的编码基因单核苷酸多态性（SNP），从中筛选与血液中胆固醇变化相关的SNPs。通过对46个GWASs数据共计10万个欧洲个体样本SNPs与血脂相关性进行分析。结果发现，位于10号染色体位点（10q11.21）上的花生四烯酸-5-脂加氧酶（ALOX5）和膜相关环指蛋白8（MARCH8）基因多态性与血液中胆固醇的水平密切相关。ALOX5基因rs12765320和rs7068039两个位点多态性与HDL-C有关，这两个位点携带TT基因型的个体血液中HDL-C水平均显著降低（图1B&C）。进一步检测rs7068039位点携带TT和CC基因型个体的apoB耗尽血清胆固醇外流能力。结果显示，与携带CC基因型的个体相比，TT基因型的胆固醇外流能力显著降低（图1D）。

以上通过对人GWASs数据分析，筛选发现ALOX5基因多态性不仅与HDL-C的含量有关，更重要的是与HDL的功能相关。

图1 ALOX5是人体内HDL-C调控因子

在小鼠中，花生四烯酸代谢途径主要包括三条通路：（1）在CoxI/II 的作用下，AA代谢生成PG2和TXA2；（2）通过ALOX5介导生成LTB4和半胱氨酸白三烯；（3）通过ALOX12/15生成LXA4和LXB4。

阿司匹林是常用的非甾体类抗炎药物，亦是非选择性环氧化酶（COX）抑制剂，因其具有抗血小板作用，在冠状动脉粥样硬化性心血管疾病的一级和二级预防中发挥重要作用，是普遍使用的药物之一。

为进一步确定从GWASs数据分析发现的新鉴定的基因突变或多态性是否可以调控AA脂氧合酶的表达，以及不同的脂氧合酶激活途径是否影响血液中胆固醇的水平或影响脂蛋白的功能特性。研究者通过构建不同的小鼠模型进行功能验证研究：1）同时激活Alox5和Alox12/15；2）敲除Alox5；3）敲除Alox12/15。

2.阿司匹林治疗促进胆固醇逆向转运

研究人员首先进行的第一个小鼠模型体内实验是通过药物抑制CoxI/II，同时诱导AA代谢过程转向在Alox5和Alox12/15作用下介导生成LXs和LTs（图2A）。C57BL6小鼠经阿司匹林治疗7天后，通过追踪³H-胆固醇标记的J774巨噬细胞观察胆固醇在小鼠体内的代谢，检测血液和粪便中³H-胆固醇水平的变化（图2B）。结果发现，阿司匹林治疗小鼠腹腔内注射³H-胆固醇标记的J774巨噬细胞24小时后，血液中³H-胆固醇水平显著降低，而粪便中³H-胆固醇水平显著升高（图2C&D）。该结果表明，粪便中³H-胆固醇含量增加可能是肝脏中³H-HDL-C摄入增加也可能是固醇胆道转运的增加所引起。

图2 阿司匹林促进RCT

3、阿司匹林促进胆汁酸排泄

胆固醇在肝脏中转变为胆汁酸，再分泌到小肠以后，部分随粪便排出。正常人每天合成的胆固醇有40%在肝脏中转变为胆汁酸。为确定阿司匹林治疗小鼠粪便中增加的固醇的类型，随后研究人员进行了RCT实验。结果发现，阿司匹林治疗小鼠粪便中的³H-酸性固醇(如胆汁酸)显著增加（78% vs 94%,P<0.0001）。COXI/II被阿司匹林抑制后，粪便中胆汁酸含量增加（图 2F）。免疫组化结果显示，在促进巨噬细胞胆固醇流出以及AS斑块退化过程中发挥重要作用的ATP结合盒转运体G11（Abcg11）在阿司匹林治疗小鼠肝脏中表达升高（图2H）。相反，肝细胞分泌胆汁酸的运载体——胆盐输出泵（Abcb11）和Abcc2蛋白表达显著降低（图2I）。

为进一步确认CoxI/II被阿司匹林抑制，阿司匹林促进胆汁酸随粪便排泄的作用，¹⁴C-甘胆酸注射到小鼠尾部，30min后检测处理组和对照组胆汁，与此前的结果一致，处理组胆汁中¹⁴C-甘胆酸增加了2倍（图2J），阿司匹林治疗对Abcb11^-/-小鼠的巨噬细胞到粪便RCT没有影响（图2K&2L）。据此，研究人员推测CoxI/II被阿司匹林抑制，阿司匹林促进了小鼠胆汁酸随粪便排泄以及通过提高肝脏Abcb11表达促进RCT效率。此外，作者还通过构建LDLr^-/-雄性小鼠模型，证实了阿司匹林可有助于AS斑块消退（图2M）。

4、阿司匹林治疗对花生四烯酸代谢的影响

为进一步探明COX I/II被阿司匹林抑制后肝脏内LTs和LXs水平的变化情况，研究人员通过qRT-PCR方法分析参与脂合成基因的表达。阿司匹林治疗小鼠中COX2表达降低，而AA脂氧合酶的表达则不受影响(图3A)。阿司匹林抑制了COXI的活性，阻断了TXA2的合成。该结果通过肝脏脂质组学的分析得到证实，阿司匹林治疗小鼠TXB2显著降低（图3B）。该结果也揭示了COX I/II被阿司匹林抑制后导致小鼠肝脏中LTs（LTB4）和LXs（LXA4）产生增多。

图3 阿司匹林治疗对花生四烯酸代谢的影响

5、白三烯和脂氧素类调控肝细胞中Abcb11、SR-BI和LDLr表达

随后研究人员通过体外的细胞实验验证体内实验的结果。从C57BL/6小鼠分离培养原代小鼠肝细胞并给予药物处理，结果显示阿司匹林及其活性代谢物水杨酸诱导Abcb11和B组I型清道夫受体(SR-BI)蛋白表达，下调LDLr蛋白的表达。SR-BI是I是高密度脂蛋白受体，可通过多种机制对动脉粥样硬化发挥效应。进一步对LTs和LXs对Abcb11表达的影响进行分析，结果显示这两类物质均可提高Abcb11表达，并且主要通过转录后和翻译后的机制对Abcb11的表达进行调控。

图4 白三烯和脂氧素通过翻译后调控机制调控Abcb11表达

6、ALOX5在胆固醇代谢和RCT中的作用

研究者进行的第二个体内实验是构建Alox5敲除小鼠模型，探讨Alox5基因敲除是否影响小鼠肝脏中Abcb11蛋白的表达、胆固醇平衡和RCT（图5A）。结果显示，Alox5^+/+和Alox5^-/-小鼠血浆中LDL-C和HDL-C均没有显著差异，而在Alox5^-/-小鼠中极低密度脂蛋白胆固醇（VLDL-C）水平增加（图 5B）。在巨噬细胞到粪便RCT实验中，与Alox5^+/+小鼠相比，Alox5^-/-小鼠血液中³H-固醇水平降低，而粪便中³H-固醇则无显著改变（图 5C&D）。免疫印迹分析显示除了LDLr蛋白表达无变化外，肝脏中Abcb11蛋白表达提高了2倍，SR-BI蛋白表达也提高了。进一步通过肝脏脂质组分析发现，Alox5^+/+和Alox5^-/-小鼠中LX水平均无明显变化，而在Alox5^-/-小鼠中LTB4水平显著降低。

图5 Aol5在Abcb11调控和胆固醇平衡中的作用

7、Alox12/15在胆固醇代谢和RCT中的作用

研究人员进一步通过构建Alox12/15基因敲除小鼠模型研究Alox12/15在胆固醇代谢和RCT中的作用。与Alox12/15^+/+小鼠相比，Alox12/15^-/-小鼠缺少Alox12/15既不影响血液中胆固醇水平也不影响巨噬细胞到粪便RCT（图6A-6D）。此外，Alox12/15^-/-小鼠肝脏中Abcb11、LDLr和SR-BI的表达均无改变（图 6E）。随后对肝脏脂质组分析发现，与Alox12/15^+/+小鼠相比，Alox12/15^-/-小鼠肝脏中LX水平无明显变化，而在Alox12/15^-/-小鼠中LTB4水平显著升高（图6F）。

图6 Aol12/15在Abcb11调控、胆固醇平衡中的作用

8、脂氧素类似物治疗可降低血液中低密度脂蛋白胆固醇

最后根据前面研究获得的一系列结果以及以期为心血管疾病的治疗提供新途径。研究人员对LXB4对小鼠胆固醇代谢的影响进行研究。结果显示，脂氧素类似物治疗显著降了低血液中总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇水平。 

图7 给予脂氧素类似物治疗降低了血液中LDL-C

结论：花生四烯酸代谢组是胆固醇代谢的主要调控因素，AA衍生物可作为人心血管疾病治疗的一类有前景的潜在药物。

（1）研究套路总结：

该研究首先通过从已发表的GWAS数据进行分析，从中筛选与疾病相关SNPs，随后通过构建动物模型、体外细胞实验，结合药理学处理，同时采用非靶向脂质组学技术进行验证，揭示了花生四烯酸代谢组在胆固醇代谢中的重要作用，为心血管疾病的临床治疗提供的新的治疗思路和途径。主要思路：挖掘已有GWAS数据→体内验证（动物模型）→脂质组分析（肝脏）→体外验证（细胞）。

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花生四烯酸及其代谢产物如前列腺素、白三烯和脂氧素是体内重要的炎症物质，参与机体免疫及炎症反应。此外，花生四烯酸及其代谢产物还可调节血管张力和血小板聚集（PT、TX等），调控肿瘤细胞的生长（PG、HETES等），与糖尿病、呼吸道疾病、皮肤病、动脉粥样硬化等多种疾病有关。

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