【老司机切磋】蛋白质组学与验证，您所关心的问题都在这里
2017-09-15
中科新生命
5101作为国内最早从事蛋白质（组）学研究，以及最早对外开展蛋白质（组）分析服务的老司机，中科新生命积累了超过10年的相关经验。在这十多年间，经历了蛋白质（组）学技术飞速发展和普及的历程，从2D凝胶电泳到TMT，从WB到MRM再到PRM，从单蛋白鉴定到组学再到修饰组等；也目睹了不断以我们的数据实现公开发表，甚至登上顶级期刊的荣誉殿堂，例如从经典的《Molecular & Cellular Proteomics》到今年的《Science》等。我们希望能够更多地分享一些自己的经验，为各位老师的蛋白质组学研究之路提供有益的帮助。
今天就与大家来聊一聊蛋白质组与后续验证的那些事~请看以下对话！
why选择这个话题来聊？
因为蛋白质组分析，是一个大规模数据采集的过程，其中不可避免地出现不准确、不真实的数据。从功利的角度来说，是否对蛋白质组学结果进行了验证，是蛋白质组学数据能否过审稿人法眼的重要因素之一。最近我们遇到了很多的老师在这个问题上栽跟头，所以觉得有必要跟大家探讨一下。
蛋白质组学结果究竟需不需要验证？
如上所述，如果要保证蛋白质组学结果与结论的准确性，非常有必要进行验证。通常实际情况中，碰到最多的问题是：“如果蛋白质组数据，没有进行验证，到底影响不影响发文章？”
在蛋白质组研究模式刚兴起的那段幸福时光中，很少有发表的文章进行验证，即使是业内头牌《Molecular & Cellular Proteomics》。但是幸福的时光总是短暂的，随着蛋白质组学研究的逐渐兴起，以及靶向分析技术的发展进步与普及，相关的要求也越来越高，直到去年的这个时候，如果有老师问我们这个问题的时候，我们的回答通常也是：“如果有验证最好，能投个影响因子高点的杂志”。但是，如果现在有老师问我们这个问题，我会毫不犹豫的说：“如果不验证，那就是给自己挖坑”。也就是说，从蛋白质组文章发表的要求来看，验证已经从早年间的“奢侈品”到前些年的“高配”，到目前的“标配”。
为什么说现在做蛋白质组不验证就是给自己挖坑，有什么悲剧可以拿出来给大家高兴高兴吗（开个玩笑，有此经历的老师别介意）？
最近我们遇到很多老师投稿时遇到的问题，就是审稿人要求对蛋白组数据进行验证，然后要求补实验。通常遇到这种补实验的项目，我已产生一丝悲观（抱歉，我本身是一个悲观主义者），很多时候最终结果也验证了我的悲观。
大多数情况下，蛋白质组要回头补实验，真心是个坑。为什么这么说？因为蛋白质组本身不可避免存在一定几率的不准确和错误率，所以通常情况下选择感兴趣的目标蛋白，再利用更特异性的方法（如WB、MRM等）进行验证时，有可能验证结果是：表达水平与蛋白质组结果并不一致。反过来说，如果都是一致的，那就没必要验证了。所以蛋白质组学结果验证，是一个去伪存真的过程，如果有不一致的结果并不是说蛋白质组做的就有问题（前提是蛋白质组实验过程有严格质控）。
大家可以想象一下，如果我没有做验证，然后把蛋白质组的结果送给审稿人评审，告诉审稿人和读者，我在蛋白质组结果中发现某些蛋白表达有差异，这个蛋白功能如何如何重要，与某个生物过程如何如何相关。如果我是审稿人，我也会问，这些蛋白的表达确实变化了吗？去做个验证的补充实验吧。如果补充验证的结果与蛋白组结果一致，那就恭喜了。但是如上所述，存在一定的风险是（从经验来说，风险还是比较高的）：验证结果与蛋白质组并不一致。So，怎么跟审稿人交差呢？这是个无法填的坑。这个坑的形成有很多因素，包括因为蛋白质组是个大规模分析，并且大家常用的扫描方式是DDA（感兴趣的老师可以去查查什么是DDA，什么是DIA），在这种扫描方式下，存在较大的数据采集的随机性。另外，还需要考虑不同批样本的生物学差异，不同批次进行的样本制备、酶解过程等都会存在或多或少的差异。如果恰巧你选择的蛋白属于丰度比较低的一类蛋白（很多老师偏向选丰度低的，因为这一类通常是功能比较重要的细胞因子或信号分子等），该风险的指数就更大了。无论是哪种分析方法，物质丰度越低、准确度就越低。
那么蛋白质组学验证正确的打开方式是什么？
依我个人的见解，蛋白质组的研究过程应该是：
如果跳过验证这一步，不但给文章发表挖坑，也给后续的研究挖坑。至于大家比较头疼的，挑选哪些差异表达蛋白进行验证，可以借鉴我们昨天发的攻略：终于找到你 | 挑选差异蛋白攻略大全 以及与差异蛋白相关的2篇内容：【老生常谈】P值是如何来的！
如你所述，验证似乎真的很重要，但问题是有很多我们感兴趣的物种和蛋白，很难获得抗体去做验证啊？
首先，我们并不建议用PCR来验证。虽然PCR几乎没什么技术限制，但是PCR反映的是mRNA水平的变化，转录水平的变化与蛋白水平并不一定是一致的，所以用PCR验证的说服力相对较低。
如果是用抗体验证，的确是个常规和公认的思路。虽然，目前也有一些对于抗体质疑的声音，（感兴趣的老师可以看看：【深度】科研抗体的水究竟有多深？起底抗体产业最大隐忧 以及我们转过的一篇：【报道】自由放任埋下的抗体“祸根”），但我个人认为抗体目前还是公认的金标准，抗体验证仍然是首选之一。当然，WB这类实验的通量比较低，多个候选一个个WB做过来，也是很要命的事，而且购买抗体的成本也不低。但是，对于个性化定制的抗体，大家还是要谨慎为好。毕竟目前定制抗体的成功率、质量、周期还是有较高风险的，包括价格也很贵。除此之外，还可以考虑采用的方法就是质谱法，包括经典的MRM/SRM和PRM方法，也是目前比较公认的验证方法。
提到SRM和PRM，貌似最近非常热，这种方法到底有多靠谱？既然也是个质谱方法，是否真的适用于蛋白质组验证呢？
关于SRM/PRM方法相关的介绍，大家可以看我们之前写过的一篇软文：新神器来袭：PRM技术——蛋白质组学验证，无缝对接！！这里就不再详细啰嗦了，小结一下：
从技术原理本身来说，该方法具备超过抗体方法的专属性、选择性；
已应用于临检，所以绝对靠谱；
已经有大量的文献应用，包括独立用MRM或PRM进行目标蛋白、修饰位点的定量，也包括用于蛋白质组、磷酸化蛋白质组、乙酰化蛋白质组的验证，文章档次覆盖《Nature》、《Cell》、《PNAS》等（如需原文，请发邮件至liwenjing@sibs.ac.cn索取）。
除了进行蛋白定量，SRM/MRM和PRM还可以对目标修饰位点进行定量和验证，这点是目前极少数抗体能够实现的，可以说是修饰蛋白质组验证的神器（APT后续会推出相关产品，敬请期待）。其中PRM可以认为是MRM的升级方法，其基于高分辨平台，实现更高的特异性和灵敏度，以及具备定性能力和更容易的方法开发。
另外，最近还发现了一个不得了的事，跟大家分享一下。（重点来了！敲黑板）
大家可以看这篇《Molecular & Cellular Proteomics》上的社论：Western Blots versus Selected Reaction Monitoring Assays: Time to Turn the Tables? 2013 Sep;12(9):2381-2. doi: 10.1074/mcp.E113.031658. 这篇社论主要探讨的就是蛋白质组的验证问题，以及WB和SRM/MRM哪个更好：
当然，我个人观点仍是WB验证仍是主流方法，短时间内不会有改变，所以哪个更好不是我关注的问题。我所关注的问题是这个社论的作者：Ruedi Aebersold，Alma L. Burlingame and Ralph A. Bradshaw。
做蛋白质组研究的老师，对Ruedi Aebersold不会陌生，此人是该领域的顶级大神之一（另外一位是Matthias Mann大神：label free分级技术就是参考此大神的方法），Ruedi Aebersold也是《Molecular & Cellular Proteomics》的编委。另外两位，可能大家相对陌生，我们来八卦一下，大家看看这个：
这两位可是蛋白组标杆杂志《Molecular & Cellular Proteomics》的正副主编大人。也就是说，作为蛋白组标杆杂志主编和大神是极力推荐大家用SRM/MRM等质谱法进行蛋白质组验证的。而且，从实际投稿遇到的情况来看，的确很多审稿人直接会推荐采用质谱法来填坑。
今天的分享到此告一段落，总结以下：
从目前的蛋白质组发展和对文章发表的要求来看，建议大家做完蛋白质组就要做验证，最好不要抱侥幸心理。如果是审稿人让你补验证，那就是天坑。
验证的方法，推荐抗体法，抗体最好是大公司的商业化抗体；或者采用SRM/MRM或PRM质谱法（更推荐PRM法），同样很靠谱、应用很广。
让我们一起拒绝挖坑（我们也不想再一个一个地被动填坑），挽救即将入坑小伙伴！
APT之前也推出过定量蛋白质组-PRM验证一站式打包服务，具体请看：【新品推介】一站式打包服务，中科PRM为您减压
现今为了推动蛋白质组验证的研究模式，我们计划在开学季，重磅推出定量蛋白质组+PRM验证项目的促销活动，促销力度十分惊人！我们希望通过此活动的推广，有更多的老师在进行蛋白质组研究时，能够逐步形成组学筛选+验证的研究习惯，为文章发表和后续深入研究打下坚实基础。活动详情将会下周公布，敬请期待！
