Environ Pollut | 杭州医学院团队揭示职业性二氧化硅暴露导致矽肺病的机制
2024-11-15
中科新生命
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矽肺是一种进行性的、不可逆的职业病，具有炎症和肺纤维化的特征。在建筑、采矿、采石和碎石等职业环境中，长期吸入大量的结晶二氧化硅会导致患病。据估计，中国有2300多万接触二氧化硅的工人具有患矽肺的风险。尽管已采取措施防止工人接触二氧化硅，但矽肺仍是世界范围内的公共健康问题，尤其是在发展中国家，造成了巨大的健康和经济损失。2019年全国尘肺病发病病例15898例，因矽肺死亡7746人。然而，矽肺的发病机制尚不清楚，也没有有效的治疗方法。矽肺的一般诊断方法通常依赖于放射学表现，但仍存在误诊现象，因此有必要补充其他方法。
杭州医学院的研究团队于2024年9月在Environmental Pollution（IF：7.6）上发表了题为“Exosomal proteomics and cytokine analysis distinguish silicosis cases from controls”的研究文章。该篇文章从外泌体蛋白质组学和免疫因子两个方面展开工作，深入探究职业性二氧化硅暴露导致矽肺病的蛋白质组学机制。接下来，就让我们跟随文章，重点了解下吧！中科新生命提供了外泌体蛋白质组检测服务。
摘要
职业性二氧化硅暴露会引起严重的矽肺疾病，目前缺乏灵敏有效的矽肺生物标志物，矽肺的发病机制尚不明确。本研究从外泌体蛋白质组学和免疫因子分析两个方面开展。首先，采用多重检测技术检测矽肺患者血浆中免疫因子的水平，结果显示，矽肺患者血浆中TNF-α、IL-6、CCL2、CXCL10、PDGF-AB的水平显著高于暴露组和对照组（p < 0.05），血浆中免疫因子水平与外泌体蛋白浓度呈正相关。其次对筛选人群血浆来源的外泌体进行数据非依赖采集（DIA），在暴露/对照、矽肺/对照、矽肺/暴露、矽肺Ⅱ期Ⅲ期组中分别鉴定出88、151、293、53个差异表达蛋白（DEP）。经过独立验证人群的平行反应监测（PRM）后，结果显示筛选与验证结果中15个DEP的变化趋势一致。相关性分析结果显示，血浆TNF-α水平与外泌体DSP、KRT78、SERPINB12、CALML5表达呈负相关，TNF-α与CALML5联合测定的AUC达0.900，灵敏度为0.714，特异度为0.933。总体而言，本研究揭示了矽肺患者、暴露组和对照组的外泌体蛋白质组学特征，表明外泌体在矽肺发病机制中具有重要意义。研究还揭示了血浆免疫因子水平与外泌体DEPs表达的结合可以提高检测效率。本研究为矽肺生物标志物的开发提供了方向，并为今后矽肺发病机制研究提供了科学依据。
实验队列
共有315名受试者参加了血浆多重免疫因子检测，其中40名被纳入筛选人群(对照组、暴露组、矽肺I期组和矽肺III期组各10名)，另外36名被纳入验证人群(对照组、暴露组和矽肺I期组各10名，以及矽肺III期组的6名受试者)。所有参与者都是男性，平均年龄大约在40岁至60岁之间。
研究步骤
步骤1：血浆多重免疫因子靶向分析；
步骤2：外泌体的提取和表征；
步骤3：外泌体蛋白质组学研究及生信分析；
步骤4：DEPs的PRM验证及DEPs和免疫因子的联合测定。
研究结果
1. 血浆多重免疫因子在不同组中具有显著差异
如图1 所示，矽肺患者血浆的TNF-α、CCL2、CXCL10和PDGF水平明显高于健康对照组和暴露组(p < 0.05)，并随矽肺病情加重而升高。矽肺组血浆IL-6水平明显高于对照组和暴露组(p < 0.05)，且随矽肺病情加重先升高后略有下降。
图1 不同组间的血浆免疫因子水平变化
2. 外泌体的表征及其蛋白浓度与血浆免疫因子水平的相关性
人血浆中分离的外泌体显示出均匀的形态和明显的杯状(图2 A)。外泌体的直径在50-200 nm之间，平均为123.0 nm(图2 B)。WB结果表明，提取的外泌体对于标记物CD9、CD81、TSG101是阳性的，而对于Calnexin是阴性的(图2 C)。暴露组工人和矽肺患者的外泌体蛋白浓度高于对照组(图2 D)。血浆中TNF-α、IL-6、CCL2、CXCL10和PDGF与外泌体蛋白浓度呈正相关。Spearman相关系数均＞0.4，血浆TNF-α水平与蛋白浓度的相关系数达到0.687(图2 F–J)。
图2 外泌体的表征以及外泌体蛋白浓度和免疫因子水平之间的相关性
3. 外泌体DIA蛋白质组学结果分析
基于DIA的蛋白质组学分析鉴定不同组中的外泌体蛋白质，鉴定出4502个蛋白质。在所有样品中共鉴定了2433个具有明确编码基因的蛋白质，其中917个蛋白质与ExoCrata数据库重叠(图3 A)。上调的蛋白质有使用FC > 1.5和p < 0.05的标准过滤，下调的蛋白质使用FC < 0.67和p < 0.05的标准过滤。不同组间差异蛋白的变化情况如图3 B、D-F所示。矽肺/对照组中一些下调的DEPs的表达与血浆免疫因子水平显著相关（图3 G）。矽肺/对照组中部分下调DEPs的表达与血浆免疫因子水平显著相关（图3 H-M）。
图3 外泌体DEPs的定量鉴定及其表达与血浆免疫因子水平的相关性分析
4. 功能通路分析
对上述结果进行生物信息学分析，暴露/对照组的DEPs在系统性红斑狼疮（SLE）、中性粒细胞胞外陷阱（NET）形成和金黄色葡萄球菌感染信号通路中富集（图4A）。在矽肺/对照组中，DEPs主要富集于PPAR、胆固醇代谢和金黄色葡萄球菌感染信号通路（图4B）。在矽肺/暴露组中，DEPs主要富集于Hippo和PI3K/Akt信号通路（图4C）。此外，在矽肺III期/矽肺I期组中，DEPs主要富集于N -聚糖生物合成信号通路（图4D）
图4 DEPs的生物信息学分析
5. DEPs的PRM验证及DEPs和免疫因子的联合测定
为了验证DEPs的实际表达，根据生物信息学分析和相关性分析，选择100个感兴趣的靶向蛋白通过PRM分析进行验证。由于部分蛋白质特性的限制及其表达的低丰度，只有48种蛋白质的58个目标肽被准确定量。根据上述DEPs表达和血浆中免疫因子水平的相关性分析(图3 G)，进一步建立了联合测定模型。DEPs和免疫因子的联合测定可以区分矽肺病例和对照组，联合测定的ROC曲线下面积(AUC)大于单独测定(图5)。联合测定血浆TNF-α水平与CALML5表达的AUC达到0.900，灵敏度为0.714，特异性为0.933（图5D）。
图5 DEPs和免疫因子联合测定的ROC曲线
小结
在这项研究中，矽肺患者、接触二氧化硅的工人和健康对照者的血浆中TNF-α、IL-6、CXCL10、CCL2、PDGF- AB和FSTL1的水平发生了显著变化。矽肺患者和暴露工人的血浆外泌体蛋白浓度明显高于对照组，并与血浆免疫因子水平呈正相关。矽肺患者的外泌体蛋白质组谱发生了显著变化，15个DEPs的变化趋势与筛选和验证结果一致。血浆TNF-α水平与外泌体DSP、KRT78、SERPINB12和CALML5的表达呈负相关，提示免疫因子与外泌体之间可能存在相互调节作用。本研究旨在探索矽肺生物标志物，为发病机制研究提供科学依据。
图6 外泌体DEP和免疫因子在矽肺发病机制中的可能作用
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