干货分享 | 单抗药物电荷异构体分析和表征（一）

单克隆抗体是一种复杂的四聚体糖蛋白，常呈现出不均一性，即“异质性”，包括电荷、疏水、形态等相关的异构体。目前，抗体类药物大多是通过哺乳动物细胞表达系统进行生产。在生产、存储以及使用过程中往往伴随着多种翻译后修饰和降解(分子大小、电荷、糖型等不均一性)的同时进行，导致其等电点(pI)或空间电荷分布等表面电荷特性发生了改变，进而导致电荷变体的生成。

图1. 抗体的结构和常见修饰

根据人用药物注册技术要求国际协调会（ICH）在Q6B指导原则和中的规定，这些异构体根据其对产品安全性和有效性的影响程度，被划分为产品相关物质和产品相关杂质。因此，对产品相关物质和产品相关杂质的准确鉴别、质量研究以及质量控制显得尤为重要。

《中国药典》人用重组单克隆抗体制品总论中规定电荷变异体检测，需采用适宜的方法检测供试品电荷变异体，如cIEF、IEX-HPLC、 疏水高效液相色谱（HIC-HPLC）、反相高效液相色谱（RP-HPLC）等方法。

由于单克隆抗体分子中产生的翻译后修饰和降解大都造成其所带电荷差异，所以常用的检测方法有离子交换色谱（IEX）、成像毛细管等电聚焦电泳（icIEF），以及毛细管等电聚焦电泳（cIEF）等。

重组单克隆抗体可基于以上分析方法分离成：酸性成分、主要成分和碱性成分。在如下图谱中，主要成分在主峰位置出峰；酸性物质在icIEF和cIEF 低于pI，CEX早于主峰被洗脱，或AEX晚于主峰被洗脱。碱性物质在icIEF和cIEF 高于 pI，CEX 晚于主峰被洗脱，或 AEX 早于主峰被洗脱。

图2. 不同电荷异构体在CEX-HPLC (右), and cIEF (左)的分布

（来源：Analytical and functional similarity of Amgen biosimilar ABP 215 to bevacizumab, mAbs, DOI:10.1080/19420862.2018.1452580）

icIEF法由于聚焦完成后不需要迁移，影响因素少，目前被认为是一个平台化方法，几乎所有样品都可以使用一个通用方法，或稍作优化即可获得较好的分析效果，因此受到了分析工作者的青睐，并已收录在2020版《中国药典》中通则3129 单抗电荷变异体测定法。

2024年2月5日，国家药典委员会发布关于通则3129 单抗电荷变异体测定法标准草案的公示。公示稿显示，在修订调整第一法，即全柱成像毛细管等电聚焦电泳法（icIEF）的基础上，增加了第二法，即毛细管等电聚焦电泳法。

icIEF 法和 cIEF 法两种方法原理基本相同，均将供试品与预混溶液（含两性电解质、等电点标志物、含尿素凝胶等）进行混合制备成供试品溶液并充满、整根毛细管，而后将毛细管两端浸入电极液并施加电压，两性电解质在毛细管内形成 pH 梯度，蛋白质迁移至各等电点区域形成聚焦条带。

相较于icIEF法，cIEF 法由于在聚焦完成后需要迁移，可能导致聚焦被破坏，分辨率可能有所下降；为保证分辨率，迁移需要非常慢的进行，因此单个样品耗时更长；但可调整的因素较多，方法开发自由度较大（可调整毛细管长度），牺牲效率的同时，对某些样品，可以提高分辨率。并且cIEF 法使用的通用性毛细管电泳仪，可以用于包括等电聚焦电泳、凝胶电泳和区带电泳等多种模式，设备可满足不同检测分析需求。