磷酸化组立新功！Neuron(IF:16.2)发表首个标识神经活性下降/关闭的标志物

基于光遗传技术诱导的低活性和高活性的原代皮层神经元；

小鼠模型（麻醉、化学遗传学、视觉刺激、水剥夺-饮水、禁食-重新进食）

研究者在原代皮层神经元上表达光敏感通道蛋白（channelrhodopsin-2，ChR2）以建立基于光遗传技术的神经元激活平台。光刺激后可产生大量同步、精确放电模式的神经元。在10cm²面积上，10ms，5mW/mm² 470nm的光刺激就足以激发高达10HZ的动作电位，在同一时间获得超过10⁶个有同步动作电位的神经元。这些激活的神经元的即刻早期基因（IEG）如Fos、Arc和Npas4的mRNA表达显著升高。

研究者对动作电位发射为0.5HZ（慢，低活性）和10HZ（快，高活性）的神经元进行了磷酸化蛋白质组检测，共检测到了7543个磷酸化肽段、约50个显著性差异磷酸化肽段。两个下调的磷酸化位点PDH E1亚基α 1a的Ser293和Ser300（PDHA1a，研究者称为pPDH）被挑选作为后续研究的目标。

PDHA1a是丙酮酸脱氢酶复合体（PDC）中的限速酶，控制丙酮酸进入氧化三羧酸循环（TCA）。TCA的激活被证明是神经元放电所必需的。PDH的磷酸化抑制酶活性，而它的去磷酸化则激活PDH，进而产生更多的ATP。这一结论与研究者发现在神经元高速放电时（高活性）pPDH显著下调相一致。研究者认为，在神经元高度活跃时，PDH去磷酸化，增加ATP的产量以满足神经元对能量的高需求。基于这种功能相关性和易于获得商业化单克隆抗体，研究者决定测试pPDH是否可以作为逆活性标志物（IAM）。

PDH Ser293和Ser300的磷酸化在原代神经元中同时被检测到。研究者继续对小鼠不同脑区中这两个位点的磷酸化进行了检测，发现pSer293 PDH是in vivo的主要形式。因此，研究者重点关注pSer293 PDH。

在5HZ连续光遗传刺激条件下，研究者检测到了比10HZ条件下更低的pPDH。在停止激活50min后，pPDH恢复到和基线相当的水平。药理抑制后，pPDH的上升，并在加入KCl后反转。以上结果表明pPDH可以受到神经元活性的双向和反向调节。

研究者接下来检测pPDH是否可以作为体内神经活性的组织学标记。研究者首先检测异氟烷麻醉导致的神经活性抑制后pPDH的水平。结果显示，麻醉2h导致脑区广泛的FOS免疫荧光信号的缺失，而研究者在多个脑区检测到了pPDH的显著上调。与早前报道一致的是，研究者同样发现，麻醉导致视上核区有显著上升的FOS，而高pPDH则在该区一群离散的神经元中被检测到。此外，并不是所有区域都表现为高pPDH，如海马的CA3区域、血脑屏障（BBB）外区，pPDH并不响应异氟烷麻醉。因此，和即刻早期基因（IEG）一样，pPDH标记也有区域偏好、偏差和差异。有趣的是，在一个非常早期的时间（麻醉后1h），脑区就可检测到强的pPDH，而FOS的缺失则不明显，这反映出与即刻早期基因（IEG）的表达相比，pPDH有更快的动态特性。

此外，研究者还发现pPDH可以标记被常见电路操作法如化学遗传学技术沉默的神经元。

研究者继续采用一种小鼠视觉刺激方案以检测视觉通路中pPDH的动态变化。小鼠首先在黑暗中保持48小时(视觉剥夺)，然后暴露在明亮的视觉刺激下4小时以诱导神经元活动，然后再次回到黑暗中2小时和12小时（此时视觉刺激诱导的活动预计会消退）。与文献报道一致，初级视觉皮层(V1)、外侧膝状体核(LGN)和边缘内嗅皮层(LEnt)的FOS信号在4小时的视觉刺激下被强烈诱导，在第二次黑暗环境12小时后才缓慢恢复到基线水平。相比之下，小鼠重新进入黑暗环境2小时后，所有三个区域的pPDH信号都显示出急剧增加，这表明视觉刺激的停止(从而降低了视觉通路的激活)可以被pPDH快速捕获。基于细胞标记染色可知，大多数pPDH标记的细胞是NeuN+神经元。

研究者继续采用小鼠水剥夺（WD）和饮水模型检测水稳态关键区MEPO（正中视前核）中pPDH的变化以确认pPDH是否可以标记行为或内在状态诱导的神经活性。小鼠在重新可获取水前被剥夺水24h。结果显示，水剥夺后MEPO区的FOS显著上升，在重新可饮水后1h，pPDH显著上升，而FOS在可饮水8h后才缓慢恢复到基线水平，再一次反映出在pPDH和FOS标记在关-动力学（off-kinetics）中的差异。

接下来，研究者检测水剥夺下全脑区的FOS和pPDH水平。结果显示，在FOS高表达的前几个脑区都有显著下降的pPDH，这表明pPDH可以以一种与FOS相反的方向标记神经活性变化。研究者开发了pPDH免疫染色的抗体和操作方法，并发现水剥夺导致的显著变化在超过10个脑区中能由pPDH的显著下降显示出来但并不能通过FOS染色变化显示出来，这提示我们通过联合pPDH和即刻早期基因（IEG）可以发现一些新的neural substrates。

此外，研究又在禁食和重新进食的小鼠模型中发现，禁食后的ARC区呈现显著升高的FOS信号和降低的pPDH信号。但在重新进食1h后，并不能检测到FOS信号的下降但可以检测到很强的pPDH信号上升。综上所述，这些数据表明pPDH提供了一种以前无法通过现有的基于IEG的活性标记物从组织学上标记神经元抑制的方法，并直接证明了使用pPDH跟踪体内神经元活性降低的可行性。

即刻早期基因（IEG）已被证明是研究不同脑区和神经元类型对各类刺激响应的有力工具。研究者继续检测pPDH是否有能力揭示较少被研究的脑区或细胞类型的动力学。

在前述的禁食-重新进食实验中，外侧下丘脑区(LH)有一群离散的神经元在禁食后表现为显著和特异性的pPDH下降，而在重新进食后又迅速恢复表达，表明这群神经元受到禁食激活和再进食抑制。然而，这种抑制并不能被FOS或其他即刻早期基因（IEG）免疫染色检测到。研究者利用pPDH和其他组织学标记物的多重标记发现这个区域的细胞类型。最终发现，Ppdh+神经元与hypocretin而不是MCH或Vgat神经元高度重合。这种由禁食-重新进食诱导的细胞类型特异性抑制在Hcrt-Cre小鼠中被验证，并与近期报道的在饮食过程中hypocretin/orexin神经元失活相一致。因此，pPDH作为一种标志物，可以用来表征一个被禁食激活但被再进食快速抑制的特异性hypocretin/orexin LH细胞群。