干货分享 | 生物活性检测系列四:ELISA
酶联免疫吸附分析方法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)是一种免疫检测方法,通常用于测量生物样品中的抗体或抗原,包括蛋白质或糖蛋白。像其他免疫检测法一样,它们依靠抗体与目标的结合来促进检测。Elisa具有特异性强、灵敏度高、方法简捷、分析容量大、检测成本低等优点,一般不需要贵重仪器,可简化或省去前处理步骤,并且可以提供系列商业化的技术产品,具有常规理化分析技术无可比拟的选择性和很高的灵敏度,非常适宜于复杂基质中特定组分的分析。Elisa包括双抗体夹心法、直接法、间接法、竞争法、捕获法等。
图1. ELISA原理示意图
案例分享一:传统ELISA法检测人生长激素结合活性
生长激素是美国食品药品监督管理局(FDA)和中国食品药品监督管理局(CFDA)批准治疗矮身材的唯一有效的药品。1985年基因重组人生长激素(rhGH)问世发展至今,人工合成的基因重组人生长激素与人脑垂体产生的生长激素的化学结构完全一样,生理、药理作用也保持一致,可明显促进矮小孩子的身高增长,并改善其全身各器官组织的生长发育。基于生长激素受体蛋白(GHR)可特异性与生长激素(GH)结合的原理,采用GHR进行固相板包被,将生长激素与受体蛋白共孵育,随后与辣根过氧化物酶(HRP)标记的生长激素抗体特异性结合。通过测量450 nm处的OD值,进而评估生长激素与受体的结合活性。
图2. 人生长激素结合活性
案例分享二: ELISA新技术(cell-based ELISA)检测特立帕肽结合活性:
骨质疏松症发生的风险随着年龄的增长而增加,由此产生的脆性骨折被称为该疾病的主要并发症。特立帕肽是目前临床汇总治疗骨质疏松症的一种新药,该药物的合成代谢作用可以增加骨更新,能够比破骨细胞更大程度地刺激成骨细胞,并减少脊椎和非脊椎骨折的发生几率。特立帕肽是甲状旁腺激素分子的34个氨基酸N末端片段的通用名,其对介导其活性的表面受体具有与天然PTH相同的结合亲和力基于特立帕肽受体蛋白(PTH1R)可特异性与特立帕肽结合的原理,采用细胞表面可表达PTH1R的细胞进行铺板,使用Cell based-ELISA实验测定特立帕肽注射液中的活性成分特立帕肽与PTH1R之间的结合活性。首先将细胞铺板于96孔板中,贴壁后使用固定液进行固定,随后与辣根过氧化物酶(HRP)标记特异性抗体(一抗)结合,通过测量450nm处的OD值,进而评估特立帕肽与受体之间的结合情况。
图3. 基于细胞的ELISA原理示意图
图4.特立帕肽-ELISA剂量效应曲线[1]
案例分享三:HTRF VS ELISA
HTRF:即均相时间分辨荧光,均相(Homogeneous)是指所有参与反应的试剂或化合物无需经过洗涤处理,反应体系内的各成分互不影响;时间分辨荧光(TRF)即TR-FRET,时间分辨荧光+共振能量转移;因此它是一种将FRET与TRF相结合的技术,通过采用两种抗体识别目标蛋白,一种抗体与供体偶联,另一种抗体与受体偶联。如果2个抗体识别到目标蛋白,供体和受体的基团接近时,引发能量转移,供体会诱导受体长时间地发射荧光,受体激发后产生的荧光便能持续较长时间,这样通过时间分辨就可以区分出FRET信号。
HTRF作为一种免洗ELISA,可应用于G蛋白耦联受体研究,激酶活性检测,免疫检查点检测,细胞因子分泌检测,抗体检测等,目前广泛应用于新药研发候选药物的大通量筛选。
图5. HTRF检测示意图
图6 HTRF测定法表征CaSR-HRK293细胞中Ba2+诱导得Gq激活通路[2]
实验原理及优缺点
ELISA方法 |
实验原理 |
优点 |
直接法 |
将抗原直接固定在固相载体上,加入酶标记的一级抗体,即可测定抗原总量 |
操作手续简短,因无须使用二抗可避免交互反应 |
间接法 |
与直接法类似,差别在于一级抗体没有酶标记,改用酶标记的二级抗体去辨识一级抗体来测定抗原量 |
二抗可以加强信号,而且有多种选择能做不同的测定分析。不加酶标记的一级抗体则能保留它更多的免疫反应性 |
双抗体夹心法 |
被检测的抗原包被在两个抗体之间,其中一个抗体将抗原固定于固相载体上,即捕捉抗体。另一个则是检测抗体,此抗体可用酶标记后直接测定抗原的量;或不标记,再透过酶标记的二级抗体来测定抗原的量 |
高灵敏、高专一性,抗原无须事先纯化 |
竞争法 |
样本里的抗原(自由抗原)和纯化并固定在固相载体上的抗原(固定抗原)一起竞争相同的抗体,当样品里的自由抗原越多,就可以结合越多的抗体,而固定抗原就只能结合到较少的抗体,反之亦然。经清洗步骤,洗去自由抗原和抗体的复合物,只留下固定抗原和抗体的复合物,拿来与只有固定抗原的对照组结果相比较,根据呈色差异就可计算出样品里的抗原含量 |
可适用比较不纯的样本,而且数据再现性很高 |
基于细胞法 |
新的定性蛋白检测技术,将细胞直接在微孔板里培养,待检测时,不需抽提蛋白和裂解细胞,便可直接测量微孔板里蛋白经刺激或抑制作用后的变化 |
无需裂解细胞,所以目标蛋白损失少;无需包被微孔板,简化实验流程,有助于提高效率 |
HTRF |
免清洗技术,使用两种识别目标蛋白的抗体,一种抗体与供体偶联,另一种抗体与受体偶联。如果 2 种抗体识别出分析物,供体在激发时会发出荧光,能量会转移到附近的受体,从而产生特异性受体荧光 |
易操作,节省时间,无需清洗,高通量 |
[1] Kovacs P, Schafer T, Hada V,et al.Comparative Physicochemical and Biological Characterisation of the Similar Biological Medicinal Product Teriparatide and Its Reference Medicinal Product[J]. BioDrugs: Clinical immunotherapeutics, biopharmaceuticals, and gene therapy, 2020(1):34.DOI:10.1007/s40259-019-00386-x.
[2] NørskovLauritsen, Lenea, Thomsen A R B ,BräunerOsborne, Hans.G Protein-Coupled Receptor Signaling Analysis Using Homogenous Time-Resolved Förster Resonance Energy Transfer (HTRF®) Technology[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2014, 15(2):2554-2572.DOI:10.3390/ijms15022554.