当PRM遇到了 “血管清道夫”—— 研究多种HDL
2017-06-28
中科新生命
5892Multiple apolipoprotein kinetics measured in human HDL by highresolution/accurate mass parallel reaction monitoring
利用高分辨精准靶向蛋白质组学技术PRM对多种人高密度脂蛋白进行蛋白动力学检测
Journal of Lipid Research IF=4.8
研究背景
在心血管系统中，低密度脂蛋白（LDL）和高密度脂蛋白（HDL）经常上演猫和老鼠的游戏。LDL携带胆固醇积存在动脉壁上，久了容易引起动脉硬化。而HDL则运载组织中的胆固醇，再转化为胆汁酸或直接通过胆汁从肠道排出。所以高密度脂蛋白是一种抗动脉粥样硬化的血浆脂蛋白，是冠心病的保护因子。因此HDL通常俗称“血管清道夫”。 然鹅，这样天使般勤劳可爱维护心血管健康的HDL，平时行事却非常低调（表达丰度低），因而增加了其研究的难度。但是，已经给大家安利过很多次的靶向蛋白质检测技术--平行反应监测（parallel reaction monitoring, PRM），因其高分辨率、高精确性以及优秀的抗背景干扰能力，为HDL动力学研究带来了契机。
实验材料
经过一系列生理指标和遗传指标筛选出的三名志愿者连续32天摄入富含不饱和脂肪的饮食。在第28天早上，三名志愿者静脉注射稳定同位素标记的D3亮氨酸（D3-Leu）。
实验流程
注射后不同时间点分别采集血样→制备血浆→富集HDL蛋白→ND-PAGE凝胶分离→胶内酶解→targeted LC/MS (PRM)相对/绝对定量。具体实验流程示意图如下：
图1. 实验流程示意图
实验结果
1. 本研究旨在建立HDL综合动力模型，揭示每一种载脂蛋白的来源和去路代谢途径。最终模型与富集曲线和志愿者pool sizes契合度极高。
2. 三名志愿者中共鉴定到58种HDL蛋白。不同分子量分布的HDL，在样本中呈现较好的聚类情况。根据其聚类分布，主要分为5组（图2）；第一组有22种蛋白，以alpha0 size为主；第二组含11种蛋白，以alpha1 和alpha2 size的HDL蛋白为主；三四五组分别主要包含8种、14种和2种HDL蛋白。
3. 三名志愿者中富集到的总apoA-Ⅰ（HDL蛋白的初级结构）pool分别为4923, 3524 和 3640 mg，这与肥胖超重的低HDL人群预期值相符。
4. 与SRM或MRM相比，PRM技术显著提高了分辨率和定量准确性（图3）。
5. 本研究中合成了FLEX标记的apoA-Ⅰ全长，并建立了PRM条件下该蛋白的内源亮氨酸（D0-Leu）和同位素标记亮氨酸（D3-Leu）的肽段检测质谱条件。PRM绝对定量结果如图4所示。
图2. 不同HDL蛋白在样本中的层次聚类图
图3. 文中PRM参数设置及其技术优越性描述
图4. HDL载脂蛋白绝对定量结果
6. 建立了HDL各馏分SAAM Ⅱ体内代谢动力模型（图5示例图展示其中APOA2的Source和Removal pathway）。
图5. APOA2代谢动力模型示例图
小编心得
本篇文献是利用PRM蛋白质靶向技术，对低丰度表达的HDL各个馏分进行绝对定量分析，发表在J Lipid Res上的方法性研究论文。文中探索了应用PRM技术对低丰度肽段检测和定量的参数，对于质谱方法学研究起到了很大的推动作用。同时建立了HDL载脂蛋白代谢动力学模型，为心血管疾病的研究夯实了基础。
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