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近来关于细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs，包括外泌体EXOs和细胞微泡MVs）的文章呈指数型增长，其被广泛应用于生物标志物研究工作。但是对于同一来源的外泌体和细胞微泡成分差别的研究却非常少。另一方面关于大脑血管内皮细胞（血脑屏障）EVs的分离与研究也非常罕见。

本文通过非靶向（label-free）和靶向蛋白质组（PRM）联合分析技术对肿瘤坏死因子（TNF）对血脑屏障及其分泌的EVs中蛋白表达的影响进行了深入探讨。

hCMEC/D3 人类大脑微血管内皮细胞（hCMEC/D3 humancerebral microvascular endothelial cells）

Label-free蛋白组学（EVs：2次生物学重复*2次技术重复；细胞：6次生物学重复）+PRM

1、采用差速离心法分离MVs（18,000g）和EXOs（100,000g）。通过免疫印迹（标志性蛋白），纳米粒子跟踪分析（NTA，囊泡大小）以及透射电镜（TEM，囊泡大小）确定MVs和EXOs的提取效果。同时发现TNF可以提高细胞分泌EVs的数量（至少两倍），但对其大小没有影响。

Figure 1. EV isolation and characterisation.

2、通过label free非标记蛋白质组学技术，细胞样品共定量到1758个蛋白 (≥ 2peptides)；MVs 910个蛋白 (≥ 2 peptides)；EXOs 575个蛋白 (≥ 2 peptides)；366个蛋白在MVs和EXOs中都存在，大部分EVs中含有的蛋白在细胞中也都能检测到。

Figure 2. (a)Workflow overview. (b) Venn diagrams displaying the totalnumber of proteins identified in cells, MVs and EXOs (≥ 2 peptides).

3、在生物学过程（biological processes）和细胞组分（cellular components）两个大类上进行GO富集分析，细胞，MVs和EXOs很多GO分类一致不过显著性存在差异：EXOs中核糖体蛋白，胞外囊泡蛋白，溶酶体膜蛋白，黏连蛋白和整合素多一些；而MVs中内质网，线粒体以及细胞骨架蛋白更多。进一步分析发现细胞，MVs和EXOs三者间相关性很弱。 

Figure 3. Heat maps displaying significant (p < 0.01) GO terms forbiological processes and cellular components.

4、利用two-way ANOVA的统计分析方法来比较三种样品中TNF刺激对蛋白表达的影响，鉴定到差异表达的蛋白：细胞75个；MVs 323个；EXOs 219个。对这些差异蛋白进行生信分析，发现TNF和NF-κB信号通路的几个蛋白在细胞，MVs以及EXOs中都存在差异。

Figure 4. (a) Venn diagram displaying differentially expressed proteinsafter exposure to TNF in different samples: cells, MVs and EXOs. For detailedlist see Supplementary Table 2. (b) Comparison of the fold-change (FC) ofproteins found to be significantly upor downregulated after exposure to TNF (p< 0.01, |FC|> 1.5) in both cells and EVs. The significant IPA canonicalpathways enriched in cell (c), MV (d) and EXO (e) samples. The significance(–log10 (p-value)) for each pathway are displayed. (f) Heat map showing the results of the IPA upstream regulator analysis.

5、最后，对一些特别关注的蛋白进行了靶向的PRM验证，如EXOs特异性蛋白（CD81, CD9, PDCD6IP和SDCB1）、MVs中蛋白（ATP5A1,RACGAP1和SEPT2）以及TNF引起的差异蛋白（ICAM1,VCAM1, STAT1, SOD2, PTX3, EGN, NFKB2），确证了label-free的数据。

Figure 5. PRM analysis of selected proteins enriched in EXOs (PDCD6IP,CD81, CD9, SDCB1) or in MVs (SEPT2, RACGAP1, ATP5A1).

Figure 6. PRM analysis of proteins found differentially expressed incells, MVs and EXOs after exposure to TNF.

本文是一篇典型非靶向组学筛选结合靶向组学验证的文章，前期利用非靶向的定量蛋白质组学分析寻找生物样品中差异表达的蛋白，后期通过靶向PRM技术对近乎30个蛋白同时进行精确定量分析，验证数据。这篇文章也充分显示出了靶向蛋白质组PRM技术的巨大优势：可以同时对几十个甚至上百个蛋白进行精确定量分析。