Label-free的华丽升级之系列报道一
2017-04-19
中科新生命
2461-江湖纷争--iTRAQ vs TMT-
在大规模蛋白质组定量分析领域，风头最盛的分析技术非iTRAQ / TMT莫属。通过将不同样本酶解后的肽段进行不同的稳定同位素标记，iTRAQ / TMT可实现多个样本合并进行分析，从而实现高度的分析平行性。
在此基础上，通过SCX或hpRP分级手段，iTRAQ / TMT的应用可带来更丰富的定性定量数据。比常规Label free更好的分析平行性、更丰富的数据结果，比SILAC更容易实现的操作，造就了 iTRAQ / TMT成为非靶向大规模蛋白质组定量的代名词的地位。
然而，即使在iTRAQ/TMT盛行的今天，仍有那么一群蛋白质组的技术控，保持着对技术方法的深刻理解和认识。我们的原则是：在科学界，合适比流行更重要，否则审稿人会代表学术消灭你…..
— Why? —
从几年前的一起案件说起
① 案情介绍（真实案例，拒绝胡诌）
▼
N种动物的乳汁，找出不同动物乳汁的差异蛋白。采用iTRAQ标记技术对N种乳汁酶解后的肽段进行标记，然后合并进行LC-MS分析。结果，审稿人认为其中某些蛋白理论上并不应该在某些物种中表达，但是在iTRAQ的结果中显示该蛋白有定量数值，实际结果与常识不符。审稿人认为该分析不适合采用iTRAQ技术，退稿处理。
被告（iTRAQ）：表示一脸懵逼
② 案情分析
由于iTRAQ标签平衡基团的存在，不同动物的乳汁经标记并混合后，其肽段的分子量完全相同，即在一级质谱上无法区分同一肽段是来自于哪种乳汁的，仅能通过二级质谱中不同iTRAQ报告基团的信号和intensity，来判断肽段的存在与否以及定量上的差异。
但是，由于二级质谱信号噪音的存在，以及iTRAQ算法及其后期归一化的校正过程，会导致即使某种乳汁中不表达某个蛋白，即肽段实际没有被对应的标签标记上，该蛋白也会被赋予一定的定量值，造成“误解”。
iTRAQ不适合分析不同物种（即使亲缘较近）的差异比较分析。
（上述论点同样适用于TMT）
③ 案情延伸
由于采用将不同样本合并上机的操作流程，且将蛋白的表达水平转换为标签比值的特殊算法，iTRAQ并不适用于所有的差异比较分析目的，如果大家有如下特殊分析情况或需求，建议采用Label free：
1. “有无差异分析”：如可能存在一组样本中有该蛋白表达，一组样本中不能检测到该蛋白表达的情况（可能为无表达，也可能为技术方法未能检测到的极低表达）；
2. 样品间蛋白pattern有明显差异：如不同物种、不同类型样本；
3. 宏蛋白质组学分析：样本由多种（不同）微生物物种共同构成；
4. 需要知道蛋白的绝对丰度的情况：如同一样本中不同蛋白间的丰度range比较，计算蛋白的拷贝数或绝对定量分析等。
（切记！切记！切记！）
④ 选择label-free的理由
Label-free之所以能够实现上述分析，来自于其天然未修饰的技术本色。下面一段话要敲黑板谨记于心：
【相比于iTRAQ/TMT等标记定量方法，Label-free是从shotgun定性分析技术直接衍生而来，其直接反应样本中蛋白、肽段的原始表达信息，能够准确体现样本内蛋白的表达情况（相比而言，iTRAQ存在压缩表达差异程度的情况），且其定量值与蛋白的绝对水平存在线性关系（如通过iBAQ值和同位素内标，可实现蛋白质组层面的绝对定量分析，Nature. 2011 May 19;473(7347):337-42）。】
（有些时候，天然美，才是真的美！）
原告：终于搞明白是怎么挂的了。但是，对于复杂样品而言，如何像 iTRAQ / TMT一样获得更多的数据呢？请看下期分解：
▼▼▼▼
低调了很久的那位（Label-free）：谁说我不能分级！！！
其实结局并没有大家想的那么完美
