鉴别含量 • 色谱分析
·检测依据
- 中国药典2020年版四部通则(0512)高效液相色谱法
- 中国药典2020年版四部通则(0514)分子排阻色谱法
·原理
- 蛋白质供试品通过高效液相色谱分析,结果利用峰面积归一法计算得出主峰的纯度百分比、分子量。
·检测范围
- 蛋白质样品,包括但不限于中间产物、原液、成品和稳定性样品。
·主要设备
- 高效液相色谱:Arc,Waters
·样品要求
- 总量:>300ug
- 状态:无色澄清液体/白色固体
- 纯度:>95%
·交付内容
- HPLC纯度(反相)
- HPLC纯度(分子筛)
- SEC-MALS分子量
SEC-MALS原理
SEC:尺寸排阻色谱法;有时称为GPC/GFC,即凝胶渗透色谱法或凝胶过滤色谱法。
GPC/SEC是根据不同的分子具有不同的流体体积而进行分离,而不是根据分子的分子量大小。色谱柱中填充了表面具有很多小孔的填料颗粒。当样品分子随流动相一起流经填料时,尺寸较小的分子能从填料颗粒表面的孔进入其内部。而较大的颗粒只能从填料颗粒之间的间隙通过。经过一段时间,样品中含有的不同尺寸的分子由于经过的路径长短不同而实现分离。通过调整填料颗粒表面的孔径大小,可以对一定分子尺寸范围的样品进行分离。
首先通过高效液相色谱的SEC柱根据供试品不同组分的不同分子尺寸分离出不同的峰(图1),再通过激光光散射检测器利用色谱柱分离出的样品在各个角度的光散射强度测量分子的尺寸大小(图2),通过示差折光检测器测出供试品洗脱液的浓度(图3),从而计算出各个组分的绝对分子质量和占比。
△图1. 尺寸排阻色谱原理示意图
△图2. 多角度激光光散射检测原理示意图
散射光与分子量,浓度以及折射率增量的平方成正比,可用以下公式表示:
△图3. 示差折光检测原理示意图
平台检测方法
柱子:TSK G3000SWXL 7.8mm × 30cm 5µm
分子量范围:10kd-500kd
流动相:25mM PB 150mM NaCl溶液
备注:若客户可提供柱子和方法,要走特殊方法的可咨询后开展检测。
案例分析
△供试品的LS 聚体信号图谱
△供试品的UV 聚体信号图谱
△供试品的分子量计算结果
注:Mn为数均分子量,Mp为峰位分子量,Mw为重均分子量,Mz为Z均分子量。