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Edman降解法N端测序在解析蛋白和多肽序列中的应用
发布日期:2017.12.05

蛋白质的N端氨基酸序列是生物药的关键质量属性之一。Edman降解法N端测序是分析这一属性的常规方法。通过Edman降解法分析N端的15个氨基酸序列在生物药申报时通常是必检项目;同时也是很多已上市生物药的年检项目(见2015年版药典)。在科研中,对未知或者不确定理论序列的蛋白可以使用N端测序为确证提供关键信息。所以该方法在科研和工业中都有广泛的应用。那么它的原理、如何分析结果以及送样的一些注意事项是什么呢?



方法原理



简单来讲,从这两个方面来理解:

第一步,Edman降解:通过PITC(苯异硫氰酸酯)这种有机试剂和蛋白或多肽N末端的α-氨基反应,使得N端的第一个氨基酸从序列上断裂得到游离的PITC衍生氨基酸,同时暴露出序列中第二个氨基酸残基的α-氨基。

第二步,测序:断裂下来的PITC衍生氨基酸通过HPLC分离后根据保留时间来判断氨基酸的种类。

这样即完成一个循环,分析出了N端的第一个氨基酸。听上去很复杂?这一系列的工作都已有自动化的测序仪来完成的。如现在市面上通用的,同时也是唯一一家在产的,岛津的PPSQ-31A/33A型蛋白测序仪。


PPSQ-31A/33A型蛋白测序仪(SHIMADZU)


结果分析



自动化测序仪哗哗跑完了实验,这实验结果还得人工分析。那么,通常我们会遇到哪些结果呢?(以第一个循环为例)

一般针对一个纯度达到95%以上的蛋白样品,测序结果出来是这样的:

清清楚楚,一个Glu的峰。(DTT、DMPTU、DPTU为试剂峰)非常明确地表明所检测样品的N端第一个氨基酸是Glu。最喜欢看到这样的实验结果了!

不过也有不一般的情况,有以下两种:

图谱中有多个氨基酸的峰。这是样品纯度不够、或者样品有降解(还是纯度不够)时会出现的情况。(不信?拿样品跑一下HPLC,或者跑个SDS-PAGE胶,也可以用质谱测分子量都可以看出样品纯度问题。)


干干净净,一个氨基酸的峰也没有!有两种原因会导致这种情况:1. N端封闭即N末端氨基酸的α-氨基被修饰(如发生了乙酰化修饰,Glu环化成焦谷氨酸等);2. 上样量太少,信号强度达不到检测线。


经过以上实例分析,下次拿到结果是不是再也不会蒙圈儿了呢?

最后,友情提示:

虽然有自动化的测序仪,但N端测序的速度相比核酸测序可要慢多了。所以,在送样前该如何对自己的样品进行一个预判,看其是否适合用此方法来分析N端序列呢? 


常见问题 Q&A


1. N端测序对蛋白样品纯度有要求吗?

是的。纯度最好能达到95%以上;否则每个循环有多个氨基酸出峰,无法归属到蛋白的序列。

 

2. 蛋白有两条或者三条链,如何进行N端序列分析?

先进行SDS-PAGE电泳将条带分开,然后将胶上的蛋白转移到PVDF膜上,丽春红染色后,分别剪切下相应的条带进行测序。

这里有两点注意事项:转膜时不要使用Tris-甘氨酸缓冲液,其会在N端测序中产生较高的背景,推荐使用CAPS缓冲液。另外对PVDF膜染色时,不要使用考马斯亮蓝,应使用丽春红染色。

 

3.什么样的样品不适合用Edman降解法N端测序来分析序列?

第一,N末端封闭的样品:从反应原理可知,N末端的α-氨基被修饰后,反应无法进行;

第二,关注的N端序列中有太多非标准氨基酸,由于没有相应的标准品,也没有办法通过N端测序来分析。此时可改用质谱法进行序列确证。


   
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