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抗体C端K缺失比例分析

——即抗体CK缺失比例分析技术服务

抗体类蛋白质药物分子重链C末端赖氨酸会有不同程度的缺失现象发生,质量控制中需要建立对这类现象的定性和定量分析的方法。C端赖氨酸 (K) 缺失后,会造成供试品酶解后C末端多肽分子的序列发生变化,并且这两种C末端多肽分子(缺失或者不缺失K)的定量结果可以反映蛋白质分子C端赖氨酸的缺失程度。

现代分析技术的发展,使得LC-MS技术可以运用到对多肽分子的定性和定量实验中。因此,本实验需要在合成供试品的理论C端多肽分子和缺失赖氨酸C端多肽分子的基础上,使用外标法建立起对供试品的C端赖氨酸缺失程度的定性定量方法。

图为Orbitrap示意图

“生物质谱技术可以在蛋白质样品的翻译后修饰定性定量分析中得到广泛应用”

生物质谱技术在定量分析中的应用

对C末端K缺失进行测定主要方法是基于质谱鉴定中的SIM扫描。SIM全称是单离子检测扫描(single ion monitoring,单离子监测),只针对一级质谱而言,即只扫一个离子,对于已知的化合物,提高某个离子的灵敏度,并排除其它离子的干扰。另外,LC-MS技术在进行定量实验时,常用三重四级杆进行MRM,但随着技术发展,质谱的分辨率和动态范围都有很大的提高。

技术指标

本方法所检测的样品是蛋白质或多肽类供试品,测量的是蛋白质C末端多肽分子赖氨酸缺失比例,测定的是多肽分子的氨基酸序列和其相对强度。

蛋白质或者多肽供试品既可以是固体样品,也可以说溶液样品。供试品的量应该不少于200μg,供试品如果为固体,应为蛋白质多肽冻干制品;如果供试品为液体,样品中蛋白质多肽浓度应尽可能在2mg/ml以上。

本方法采用外标法。标准品的标准曲线线性相关度应大于0.9。质谱数据经软件MASCOT分析,鉴定肽段的significant P需小于0.05,且Mascot Score值需大于20。

蛋白质C末端测定方法所使用的仪器是,Thermo公司生产的高校液相串联质谱仪Q Exactive和Easy Nlc1000。

案例分析

下图显示一个K缺失实验中标准肽段的标准曲线(XIC积分值)。

下图为抗体蛋白质供试品的C末端K缺失比例的XIC图谱。

Q&A

1)    抗体C端K缺失比例分析实验参数的简介。

Item

Value

Type of Search

MS/MS Ion Search

Enzyme

Trypsin

Mass Values

Monoisotopic

Max Missed Cleavages

2

Variable Modifications

Carbamidomethyl (C),

Oxidation (M)

Peptide Tolerance

20 ppm

MS2 Tolerance

0.1 Da

Fragmentation

HCD

2)      质谱定量实验中的内标法和外标法选择。

内标法是在分析测定样品中某组分含量时,加入一种内标物质以校准和消除出于操作条件的波动而对结果产生的影响。采用内标法定量时,内标物的选择是一项十分重要的工作。理想地说,内标物应当是一种能得到纯样的已知化合物,这样它能以准确、已知的量加到样品中去,它应当和被分析的样品组分有基本相同或尽可能一致的物理化学性质、色谱行为和响应特征,最好是被分析物质的一个 同系物。当然, 在色谱分析条件下,内标物必须能与样品中各组分充分分离。

外标法不是把标准物质加入到被测样品中,而是在与被测样品相同的色谱条件下单独测定,把得到的色谱峰面积与被测组分的色谱峰面积进行比较求得被测组分的含量。外标物与被测组分同为一种物质但要求有一定的纯度,分析时外标物的浓度应与被测物浓度相接近,以利于定量分析的准确性。


   
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