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糖谱检测

——即蛋白质药物的糖型分析技术服务

糖基化在生物系统中重要功能,准确鉴定蛋白质多肽类药物的糖基化情况是蛋白药物监管指导原则中的一部分。相对分子质量作为蛋白质样品的主要特征参数之一,是确定一种新型蛋白、进行蛋白质后续研究活动的重要前提。

随着现代分析技术的发展,特别是高分辨质谱技术——高分辨的准确质量数(HR/AM)Orbitrap质谱能够实现蛋白质相对分子量的测定。APT通过分别测定脱糖前后样品的分子量,其差值即为糖链的分子量,进而根据分子量推测其糖型。


“抗体类蛋白质药物的糖型定性定量分析是质控分析中的重要组成部分”

技术指标

APT糖型分析的样品纯度在99%以上,脱糖由PNGaseF酶处理,样品由Q Exactive质谱仪(Thermo Finnigan)进行质谱分析。分析时长:20min;检测方式:正离子;母离子扫描范围:1000-4000m/z;一级质谱分辨率:17500;AGC target:3e6;In-source CID:45eV;Maximum IT:250ms。

技术原理

糖基化对蛋白的生物活性至关重要,因此,需要对多批次抗体的糖基化形式都进行表征,检测其糖基化形式的变化范围,之后证明该单抗药物的糖型结构在参照糖型的变化范围内。抗体糖基化修饰的表征分为3个层面:全抗体糖型分析、糖基化位点分析、寡糖链分析。

利用高分辨率分子量测定对全抗体糖型进行分析时,是根据脱糖前后蛋白质的高分辨率分子量结果,可以计算出其糖链的分子量。与抗体类蛋白质药物常见的一些糖基化修饰相对照,可以确定其糖型。从去卷积后的分子量图谱中和质谱峰面积可以获得相应的糖型以及比例关系。

几种常见的抗体糖基化修饰

案例分析

下面两幅图谱分别表示样品脱糖前、后的相对分子质量。

图为糖型分析中脱糖前的高分辨率质谱计算出的相对分子质量

图为糖型分析中脱糖后的高分辨率质谱计算出的相对分子质量

该项目原始数据由Protein Deconvolution Version 1.0 (Thermo)软件处理,采用ReSpectTM算法。参数设置:Charge Carrier:H+;Noise Rejection:95% confidence;Target Mass:150000;Minimum Adjacent Charges:15;Mass Tolerance:0.05Da。

样品分别测定脱糖前后的分子量,差值即为糖链的分子量,进而根据分子量推测其糖型。根据图谱中样品脱糖前后分子量的差异得出样品中3种主要糖链的分子量:2891.40 Da,3054.94 Da,3213.96 Da。通过样品所含糖链的实测分子量与几种类型N-糖的理论分子量进行匹配后发现,G0F/ G0F、G0F/ G1F、G1F/ G1F三种N-糖的分子量与实测分子量非常接近,与单克隆抗体所具有的N-糖类型相符。3种糖链分子量差值分别为163.5 Da和159.0 Da,根据已知的糖型可知3种糖链之间相差一个半乳糖。

用质谱峰面积(Protein Deconvolution 1.0)计算3种糖型的分子量,结果为G0F/ G0F : G0F/ G1F : G1F/ G1F=X : X : X。

Q&A

1)   糖型的定性分析和高分辨率分子量测定之间的关系。

糖基化对蛋白的生物活性至关重要,因此,需要对多批次抗体的糖基化形式进行表征,检测其糖基化形式的变化范围。之后证明该单抗药物的糖型结构在参照的糖型的变化范围内。抗体糖基化修饰的表征分为3个层面:全抗体糖型分析、糖基化位点分析、寡糖链分析。我们是采用高分辨率分子量测定对全抗体糖型进行分析。

2)   脱糖前后的糖基化蛋白质高精度分子量分析方法。

根据脱糖前后蛋白质的高分辨率分子量结果,可以计算出其糖链的分子量。与抗体类蛋白质药物常见的一些糖基化修饰相对照,可以确定其糖型。从去卷积后的分子量图谱中和质谱峰面积可以获得相应的糖型以及比例关系。

   
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