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圆二色谱(远/近紫外)

——即蛋白质药物的圆二色谱分析技术服务

目前研究蛋白质、多肽的二级及高级结构的方法有几种,如X-ray晶体衍射技术、核磁共振技术和圆二色谱技术等。前两种方法较复杂,并且受很多因素影响,分析起来比较困难。相对而言,圆二色谱是一种比较简单且有效的技术,也是目前研究蛋白质二级结构的主要手段之一。

圆二色谱仪的工作原理是:利用蛋白质的圆二色性及不对称分子对左右圆偏振光吸收的不同来进行结构分析。蛋白质或多肽中主要的光活性基团是肽键、芳香氨基酸残基及二硫键等,当平面圆偏振光的吸收不相同时,会产生吸收差值。由于这种吸收差的存在,造成了偏振光矢量的振幅差,圆偏振光变成了椭圆偏振光,即蛋白质的圆二色性。通过圆二色谱扫描仪,可以在一定程度上分析蛋白质、多肽样品的二级结构和高级结构。


“蛋白质多肽的圆二色谱分析对于研究二级和高级结构非常有意义”

技术指标

圆二色谱分析的供试品,大多数情况下的蛋白质和多肽。蛋白质的精确浓度是计算样品二级结构的关键,一般要求样品浓度为0.2μg/μl,浓度过高,测试时信号不好,需稀释,样品纯度要在90%以上,不要添加任何保护剂或其它物质,样品中应避免含有光吸收的杂质,缓冲剂和溶剂在配制溶液前最好做单独的检查,透明性极好的磷酸盐可用作缓冲体系。

圆二色谱在远紫外区的扫描图谱,反映的是蛋白质肽键的排布信息,计算所得的是蛋白质二级结构比例,即α-螺旋、β-折叠、转角和不规则卷曲的比例。

圆二色谱在近紫外区的扫描图谱,反映的是蛋白质侧链生色基团色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸等残基的排布信息和二硫键微环境的变化。

案例分析

下图分别为蛋白质样品和其对照品在远紫外区和近紫外区的Overlay图。

图为蛋白类供试品的远紫外Overlay图谱(蓝色代表样品,绿色代表对照品)

图为蛋白类供试品的近紫外Overlay图谱(蓝色代表样品,绿色代表对照品)

样品及其对照品的二级结构含量分析结果如下图,两者的二级结构含量相似。

结果:样品和对照品的远、近紫外区的圆二色谱图,经Overlay处理后图谱基本重叠;远紫外区的圆二色谱图经过分析二级结构后,各种二级结构含量也基本一致,说明样品和对照品具有一致的二级结构和空间结构。

Q&A

1)     圆二色谱的解读。

圆二色谱技术能快速、简单、较准确地研究溶液中蛋白质和多肽的构象,并且运用断流、电化学等附加装置,结合温度、时间等变化参数,已经广泛用于了解蛋白质-配体的相互作用,监测蛋白质分子在外界条件诱导下发生的构象变化,探讨蛋白质折叠、失活过程中的热力学与动力学等多方面的研究。

2)     圆二色谱分析的软件介绍。

圆二色谱在远紫外区的扫描图谱,反映的是蛋白质肽键的排布信息,计算所得的是蛋白质二级结构比例;圆二色谱在近紫外区的扫描图谱,反映的是蛋白质侧链生色基团色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸等残基的排布信息和二硫键微环境的变化。

目前用于拆分和估算的软件不下十几种,得到研究者广泛认同的计算模式有几种,但由于不同计算模式的理论基础不同,所计算得到的蛋白质二级结构比例并不完全相同,但多数软件对α-螺旋的估计还是比较准确的。APT采用JWSSE32软件对样品和对照品的二级结构进行拟合计算,参考标准曲线采用软件自带的标准α-螺旋(α-helix)、β-折叠(beta-pleated sheet)、转角(turn)和不规则卷曲(random coil)曲线。由于本预测结构可能存在误差,仅供参考之用。

   
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