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C端测序

——即质谱法蛋白质N/C端氨基酸序列分析技术服务

蛋白质样品的N/C末端序列分析,对于医药工业来说是非常重要的信息。目前N末端序列分析大多采取Edman降解法,但Edman降解法不能解决N端封闭和蛋白质修饰的测序问题,而质谱法测序则不受限制。蛋白质的C末端分析,并不能采取类似N端氨基酸序列分析的化学分析。无论是国内要求,还是国外药典,现阶段都是采取质谱法对蛋白质样品的C末端序列分析。20世纪80年代末发展的基质辅助激光解吸电离(MALDI)和电喷雾电离(ESI)使质谱技术在蛋白质结构分析上的应用发生了革命性飞跃。肽段在质谱中的碎裂有一定规律,通常最容易断裂的是肽键位置,得到分别命名为b离子和y离子的M/Z图谱,分析图谱得到蛋白质的N/C端序列。

“Edman降解法并不能解决所有的蛋白质氨基酸序列测定问题。”

电喷雾电离(ESI)质谱可以对蛋白质或者多肽样品的N/C端氨基酸序列进行鉴定。APT为客户进行N/C端氨基酸序列分析的仪器为LTQ-Velos,这是一种双压线性离子阱质谱,在定量和定性分析方面都具有优势。由于高传输离子透镜和快速扫描双压阱,LTQ-Velos显著提高了碎裂能力,将碎裂时间缩短,同时提高质谱分辨率。LTQ-Velos可以与液相色谱兼容,并同时快速分析大量蛋白质成分。


技术指标

■  蛋白质酶解产物经毛细管高效液相色谱脱盐及分离后用LTQ-Velos质谱仪(Thermo Finnigan, San Jose, CA)进行质谱分析。

    进样方式:Microspray;

    毛细管温度:200℃;

    检测方式:正离子;

    多肽和多肽碎片的质量电荷比按照下列方法采集:每次全扫描(full scan)后采集20个碎片图谱(MS2 scan)。

■  LTQ-Velos 产生的原始数据由Bioworks 3.3 软件查库,搜索使用的数据库为根据样品理论序列建立的蛋白库,数据筛选参数为:Xcorr≥1.9 (Charge 1), Xcorr≥2.2 (Charge 2),Xcorr≥3.75 (Charge 3)。

案例分析

抗体类蛋白质样品的N/C端氨基酸序列分析

其中Trypsin酶解后的样品经过LC-MS/MS分析后,得到和理论C端序列(************)相符合的MS2图谱,此MS2图谱为2电荷离子,Xcorr得分为3.3,超过可信标准的要求(Xcorr≥2.2),图谱如下:


质谱法C端氨基酸序列测定的图谱(实例),b、y离子匹配图谱

Q&A

1)    质谱法N/C端氨基酸序列测定和Edman法的互补关系。

尽管Edman法技术已近乎完善,但仍有不尽人意之处,例如Edman降解法不能解决N端封闭的测序问题(环化、封闭)、被修饰的蛋白不能给出确切的信号,要求蛋白或多肽的纯度在95%以上,灵敏度较低。质谱法不受N末端封闭的限制,能对侧链基团翻译后加工或化学修饰进行定位,灵敏度很高,因而具有其独特优势,与传统的Edman降解法相互补。

2)    蛋白质样品的C末端降解的定性定量分析。

抗体类蛋白质药物分子重链C末端赖氨酸会有不同程度的缺失现象发生,质量控制中需要建立对这类现象的定性和定量分析方法。C端赖氨酸(K)缺失后,会造成供试品酶解后C末端多肽分子的序列发生变化,并且这两种C末端多肽分子(缺失或者不缺失K)的定量结果可以反映蛋白质分子C端赖氨酸的缺失程度。

APT在合成供试品理论C端多肽分子和缺失赖氨酸C端多肽分子的基础上,使用外标法建立起对供试品C端赖氨酸缺失程度的定性定量方法。

   
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