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高分辨质谱分子量

——即高分辨率质谱蛋白质精确分子量的技术服务

现代质谱仪在上个世纪九十年代以后,在生物学领域中得到广泛应用。其中蛋白质多肽类生物大分子的分子量质谱分析也成为现实,主要使用两种类型质谱:一种是MALDI-TOF直接对分子量进行测量;另一种是使用高分辨率质谱分析电喷雾得到的多电荷信号,然后对信号进行去卷积分析,获得精确分子量数值。

采用直接MALDI-TOF进行分子量测定的主要问题是,MALDI-TOF质谱仪在不同质量区域内分辨率差别很大,分子量越大,分辨率越低。因此当样品为大分子蛋白质样品(比如抗体类药物)时,MALDI-TOF无法测得精确分子量,更不用说对蛋白质的糖基化等修饰形式进行分析。

“对LC-MS数据进行Deconvolution(去卷积)可以得到蛋白质精确分子量”

(1) 抗体类蛋白质药物的精确分子量测定

抗体类蛋白质药物是生物医药界非常重要的一类样品,这些蛋白质分子的分子量非常大,一般情况下150KDa左右。因此在没有高分辨率质谱仪的情况下,要对这类蛋白质进行精确分子量测定是困难的。

在高分辨率质谱仪,特别是orbitrap原理的质谱仪出现以后,抗体类蛋白质的去卷积分子量测定变得容易实现。

下图中可以看到抗体蛋白质分子在高分辨率质谱上的多电荷信号,通过专用的deconvolution软件分析,可以得到如下图中所示的精确分子量数据。图中显示的是一个未脱糖的抗体蛋白质的精确分子量图谱,可清晰分析到不同糖基化形式。

(2) 还原后抗体类样品的不同亚基精确分子量测定

抗体类蛋白质样品通过还原,可以将轻链和重链分开,然后通过HPLC分离,在线进行MS分析得到亚基的精确分子量。

APT为客户研发如上所述的抗体类蛋白质样品的亚基还原和精确分子量测定。下图中可以看到,抗体类蛋白质样品经过DTT还原后,分离成了轻重两个亚基,在反相色谱上可以得到有效的分离。只要通过在线的LC-MS分析,即可对亚基进行MS测定,得到精确分子量数据(其中可以看到重链中是否糖基化的两个情况)。

              

还原后抗体蛋白质分子的精确分子量分析图谱。左图为HPLC图谱;右图为质谱图谱。

(3) 小分子量(<25KDa)蛋白质样品的精确分子量测定

常用蛋白质样品包括抗体类蛋白质(150 KDa),同时也包括一些相对较小的蛋白质分子。对着这些相对较小的蛋白质,进行LC-MS分析,并去卷积分析得到精确分子量,不需要太高的分辨率即可实现(早期的离子阱,如LTQ就可以实现对小分子量蛋白质的分子量测定)。

APT现在使用Q Exactive质谱进行精确分子量测定,能力上对于这些蛋白质分子更是绰绰有余。

下图中显示的是对典型的小分子量蛋白质细胞色素C的精确分子量测定。可以看到质谱信号的分辨率在14个电荷时达到50,000以上,每个同位素峰都能够得到完美分析,分子量测定可以做到subppm级。

技术指标

高分辨率质谱可以对蛋白质样品(约10-150KDa)进行精确分子量测定,精度达到1Da左右,可以满足分析蛋白质的修饰状态(比如糖基化、磷酸化、氧化、C末端K缺失情况等),并可以对这些修饰情况进行定量分析。

APT为客户进行精确分子量测定的设备为Q Exactive,这是一种高分辨率质谱,采用Orbitrap检测器,分辨率可任意调整(最高可达140,000 at 200m/z)。一般情况下APT可以为客户提供在线LC系统对蛋白质分子进行分离后MS分析,因此可满足对样品中不同亚基的同时分析。

案例分析

案例一:抗体类药物样品的精确分子量测定实例。

APT通过online反相色谱分离后,直接用Q Exactive质谱仪对原始信号进行采集。然后使用ProMass for XcaliburTM对原始数据进行deconvolution计算,得到样品精确分子量。

从去卷积结果中可以准确读取抗体蛋白质的分子量信息(同位素分子量,而不是平均分子量)。

图谱中显示,该抗体的不同糖基化异构体的分子量信息,可以从这些信息中推测具体的糖基化组成。肽谱中还可以得到不同的糖基化异构体之间的数量比例关系,有助于进行糖型方面的质量控制。

抗体类蛋白质样品的精确分子量测定图谱

案例二:小分子蛋白质样品的精确分子量测定实例。

小分子量蛋白质(<25KDa)的deconvolution算法有所不同,所需要质谱分辨率也可以相应降低。APT为客户进行此类服务时,也通过在线LC-MS(Q Exactive)采集原始数据,并使用Protein DeconvolutionTM或者ProMass for XcaliburTM进行去卷积分析。由于Q Exactive分辨率远远大于小分子解析所需,因此可以非常容易获得高质量的精确分子量图谱。

小分子蛋白质样品的精确分子量测定图谱(Deconvolution)

“精确测定完整蛋白质分子量,帮助客户获得准确和全面的蛋白质序列结构信息。”

Q&A

1)    高分辨率质谱仪是精确测定蛋白质分子量的基石。

完整蛋白质样品通过LC-MS进行精确分子量测定,需要对得到图谱进行去卷积分析后获得实际分子量。蛋白质分子在ESI条件下获得质谱信号,都是多电荷图谱,质谱信号的分辨率高低成为是否能进行成功去卷积的关键。APT为客户提供精确分子量测定工作使用的是Q Exactive,最高可以提供140,000(m/z 200)的分辨率,完全满足各种蛋白质分子量的测定要求。

2)    精确测定完整蛋白质分子量的优点。

通过LC-MS(高分辨率质谱)分析,获得完整蛋白质的精确分子量,因为其精度高、信息量大和可以与多种前处理方案联用等等优点,必将受到医药工业界的青睐。MALDI-TOF由于分辨率有限,加之其得到的多为单电荷和少电荷的信号,对于大分子量的蛋白质分子,只能得到平均分子量信息。蛋白质分子由于氨基酸序列很长,因此平均分子量和同位素分子量差距较大。而ATP提供的去卷积后精确测定分子量,因为获得的是多电荷信号,加上Q Exactive能够提供高分辨率和高精度信号,因此经过解析后得到精确分子量和理论分子量之间误差在数个ppm(对于抗体类蛋白质分子,误差仅1Da左右)。

   
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